Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.
Abstract
Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen, hoe passage hESC' s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen.
Protocol
hESC cultuur dagelijks onderhoud hESC cultuur media moeten worden veranderd om de 24 uur. Van de ES media voorraad fles bewaard bij 4 ° C, neemt de hoeveelheid oplossing nodig is (~ 20 ml per 6-well plaat), plaats in een 50 ml falcon buis, en warm tot 37 ° C in een waterbad. Zodra de media is opgewarmd, voeg bFGF opgeslagen bij 4 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml. Plaats de bFGF voorraad bij 4 ° C direct na gebruik! Alle uit de 6-well platen, maar ~ 500μl van de media. Zorg erv…
Discussion
Deze video laat zien hoe passage hESC 's van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat te bevestigen in feeder-vrije kweekomstandigheden.
Acknowledgements
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
Thomson, J. a. m. e. s. A., Itskovitz-Eldor, J. o. s. e. p. h., Shapiro, S. a. n. d. e. r. S., Waknitz, M. i. c. h. e. l. l. e. A., Swiergiel, J. e. n. n. i. f. e. r. J., Marshall, V. i. v. i. e. n. n. e. S., Jones, J. e. f. f. r. e. y. M. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .Science. 282, 1145-1147 (1998).
Xu, C. h. u. n. h. u. i., Inokuma, M. a. r. g. a. r. e. t. S., Denham, J. e. r. r. o. d., Golds, K. a. t. h. a. l. e. e. n., Kundu, P. r. a. t. i. m. a., Gold, J. o. s. e. p. h. D., Carpenter, M. e. l. i. s. s. a. K. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Khvorostov, I., Zhang, J., Teitell, M. From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel. J. Vis. Exp. (16), e831, doi:10.3791/831 (2008).