최근까지, 인간의 두뇌에 대한 표현 연구 RNA 또는 단백질의 양을 정함으로 제한했다. 이 문서에 설명되어있는 염색질 immunoprecipitation 기술과 함께, 그것은 사후 두뇌에서 유전자 발현의 히스톤 methylation 및 기타 epigenetic 규제를지도로 가능합니다.
Abstract
이러한 정신 분열증, 양극성 질환과 자폐증과 같은 만성 질병 neuropsychiatric은 유전자 발현과 다른 분자 병리의 epigenetic 변경의 결과 수도 유전과 환경 요인의 조합에서 결과로 생각되고 있습니다. 전통적으로 그러나, 사후 두뇌의 표현 연구 mRNA 또는 단백질의 부량에 국한되어 있었다. 이러한 autolysis 시간과 조직 integrities에 variabilities으로 사후 뇌 연구에있어서 제한은 또한 높은 주문 염색질 구조의 연구에 영향을 가능성이 있습니다. 그러나, DNA를 포함한 게놈 DNA의 nucleosomal 조직 : 바인딩 핵심 히스톤은 – 대부분 다양한 뇌 은행에서 제공하는 대표적인 표본의 보존에 나타납니다. 따라서, 그것은 methylation 패턴과 사후 두뇌에 정의된 게놈 loci에서 핵심 histones의 다른 공유 결합 수정을 공부하는 것이 가능합니다. 여기, 우리는 냉동 (- 고정하지 않음) 인간의 두뇌 표본에 대한 간단한 기본 염색질 immunoprecipitation (NChIP) 프로토콜을 제시한다. 두뇌 homogenates의 micrococcal nuclease의 소화를 시작으로, NChIP는 qPCR 다음은 3 일 이내에 완료할 수 있습니다. 여기에 제시 방법은 정상과 병적인 인간의 두뇌에서 유전자 발현의 epigenetic 메커니즘을 명료하게하다하는 데 유용합니다.
Protocol
절차 : 1 일 데이 1. 버퍼 Douncing와 냉동 사후 회색 물질 조직 50-500 MG를 균질. ! 주의 – 인간의 조직은 엄격한 안전 조건 하에서 유의해서 다루어 져야한다. 이것은 BSL – 2 이상의 안전 기준에서 처리되어야합니다. -80에서 이전 해부, 사후 뇌를 꺼내 ° C는 Douncing 버퍼의 배 뇌 용적에서 그들을 다운스, 및 2.0 ML의…
Discussion
프로토콜이 염색질 표시가 (히스톤) 아세틸화 및 인산화 하나를 포함하여 수정의 다른 유형에 비해 사후 유물이 적은 경향이있을 수 있기 때문에, 인간 두뇌의 히스톤 및 / 또는 DNA methylation 서명에 관심이 조사에 특히 유용합니다 여기에 설명된 2. 사후 두뇌는 모노 nucleosomal 준비 연구 의무이며 DNA가 최소한의 범위에서 일반적으로 대표 autolysis 간격 (죽음과 냉동 / 조직의 저장 사이의 시?…
Acknowledgements
이 작품은 정신 건강의 국립 연구소 (5R01MH071476)에서 부여에 의해 지원되었다.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Tris-HCl
EMD
9310
Magnesium Chloride Hexahydrate
OmniPur
5980
Calcium Chloride
Fisher Scientific
C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0
OmniPur
4055
Sodium Chloride
Mallinckrodt Chemicals
7581-06
SDS Solution 10% (w/v)
Bio-Rad
161-0416
Triton X-100
Fluka
93426
Igepal CA-630
Sigma
I-3021
Sodium Deoxycholate
Sigma
D6750-25G
Lithium Chloride
Sigma
L9650-100G
Sodium Bicarbonate
Sigma
S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)
Sigma
S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus
Sigma
N3755-200UN
Benzamidine
Fluka
12072
Phenylmethanesulfonylfluoride
Sigma
P7626-1G
3M DTT
Fluka
43815
Protein G Agarose, Fast Flow
Upstate
16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit
Stratagene
201190
Proteinase K from Engyodontium album
Sigma
P2308
Phenol:Chloroform 1:1
OmniPur
6810
Glycogen, From Mussels
Sigma
G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)
Pharmco-AAPER
111000200
Solutions:
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.