עד לאחרונה, מחקרים ביטוי על המוח האנושי היו מוגבלים כימות של RNA או חלבון. בעזרת טכניקות immunoprecipitation הכרומטין המתואר במאמר זה, ניתן יהיה למפות מתילציה היסטון ורגולטורים אחרים epigenetic של ביטוי גנים במוח שלאחר המוות.
Abstract
מחלות נוירו כרונית כגון סכיזופרניה, מחלה דו קוטבית אוטיזם נחשבים כתוצאה משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים שעשויים לגרום לשינויים epigenetic של ביטוי גנים לפתולוגיה מולקולרית אחרים. באופן מסורתי, עם זאת, מחקרים ביטוי במוח שלאחר המוות הוגבלו כימות mRNA או חלבון. המגבלות נתקל במחקר שלאחר המוות המוח כגון variabilities בזמן autolysis ו integrities רקמות עשויים גם להשפיע מחקרים של מבנים גבוהים על מנת הכרומטין. עם זאת, הארגון nucleosomal של הדנ"א הגנומי כולל ה-DNA: ליבה היסטון מחייב – נראה להישמר בעיקר מדגמים מייצגים הניתנים על ידי בנקים שונים במוח. לפיכך, ניתן ללמוד את דפוס מתילציה ושינויים קוולנטיים אחרים של ההיסטונים הליבה לוקוסים הגנומי מוגדרים במוח שלאחר המוות. כאן, אנו מציגים פשוטה יליד הכרומטין immunoprecipitation (NChIP) פרוטוקול קפוא (לא קבועה) דגימות מוח אנושי. החל העיכול nuclease micrococcal homogenates של המוח, בעקבות NChIP ידי qPCR ניתן להשלים בתוך שלושה ימים. המתודולוגיה המוצגת כאן צריך להיות שימושי להבהיר מנגנוני epigenetic של ביטוי גנים במוח אנושיים בריאים וחולים.
Protocol
נוהל: 1 st יום 1. Homogenize 50-500 מ"ג של רקמת שלאחר המוות אפור קפוא משנה עם Douncing חוצץ. ! זהירות – רקמה אנושית יש לטפל בזהירות תחת תנאי בטיחות מחמירים. ז?…
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא שימושי במיוחד עבור החוקרים מעוניינים חתימות מתילציה היסטון ו / או ה-DNA של המוח האנושי, כי אלה סימנים הכרומטין ניתן נוטה פחות חפצים הנתיחה שלאחר המוות לעומת סוגים אחרים של שינויים, כולל acetylation (היסטון) ו זירחון 1, 2. המוח הנתיחה ניתנת ללימוד מונו nucleosomal …
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות הנפש (5R01MH071476).
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Tris-HCl
EMD
9310
Magnesium Chloride Hexahydrate
OmniPur
5980
Calcium Chloride
Fisher Scientific
C614-3
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0
OmniPur
4055
Sodium Chloride
Mallinckrodt Chemicals
7581-06
SDS Solution 10% (w/v)
Bio-Rad
161-0416
Triton X-100
Fluka
93426
Igepal CA-630
Sigma
I-3021
Sodium Deoxycholate
Sigma
D6750-25G
Lithium Chloride
Sigma
L9650-100G
Sodium Bicarbonate
Sigma
S7277-250G
Sodium Acetate (anhydrous)
Sigma
S-2889
Nuclease micrococcal from Staphylococcus
Sigma
N3755-200UN
Benzamidine
Fluka
12072
Phenylmethanesulfonylfluoride
Sigma
P7626-1G
3M DTT
Fluka
43815
Protein G Agarose, Fast Flow
Upstate
16-266
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit
Stratagene
201190
Proteinase K from Engyodontium album
Sigma
P2308
Phenol:Chloroform 1:1
OmniPur
6810
Glycogen, From Mussels
Sigma
G1767-1VL
Ethyl Alcohol (200 Proof)
Pharmco-AAPER
111000200
Solutions:
nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.