Fino a tempi recenti, studi di espressione sul cervello umano sono stati limitati alla quantificazione di RNA o proteine. Con le tecniche di immunoprecipitazione della cromatina descritte in questo documento, sarà possibile mappare metilazione dell'istone e gli altri regolatori epigenetici dell'espressione genica nel cervello post-mortem.
Croniche malattie neuropsichiatriche come la schizofrenia, malattia bipolare e l'autismo si pensa che il risultato di una combinazione di fattori genetici e ambientali che potrebbero risultare in alterazioni epigenetiche dell'espressione genica e di altre patologia molecolare. Tradizionalmente, tuttavia, studi di espressione nel cervello post-mortem erano limitati alla quantificazione di mRNA o proteine. I limiti riscontrati nella ricerca sul cervello post-mortem come variabilità nel tempo e integrities autolisi dei tessuti sono anche suscettibili di influenzare tutti gli studi di strutture di ordine superiore della cromatina. Tuttavia, l'organizzazione nucleosomal di DNA genomico tra cui DNA: istone nucleo vincolante – sembra essere in gran parte conservati in campioni rappresentativi forniti dalle banche del cervello diverse. Pertanto, è possibile studiare il modello di metilazione ed altre modifiche covalenti istoni del nucleo a definire loci genomici nel cervello post-mortem. Qui vi presentiamo una versione semplificata nativo immunoprecipitazione della cromatina (NChIP) protocollo per surgelati (mai-fisso) campioni del cervello umano. A partire dalla digestione micrococcal nucleasi omogenati di cervello, NChIP seguita da qPCR può essere completata entro tre giorni. La metodologia qui presentata dovrebbe essere utile a chiarire i meccanismi epigenetici dell'espressione genica in condizioni normali e malate del cervello umano.
Il protocollo qui descritto è particolarmente utile per i ricercatori interessati ad firme metilazione dell'istone e / o il DNA del cervello umano, perché questi segni cromatina può essere meno soggetti a post-mortem artefatti rispetto ad altri tipi di modifiche, tra cui (gli istoni) acetilazione e fosforilazione 1, 2. Il cervello post-mortem è riconducibile allo studio di mono-nucleosomal preparati; il DNA rimane in gran parte collegata al istoni core, almeno negli esemplari con intervalli autolisi rappresentante (il tem…
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institute of Mental Health (5R01MH071476).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
3M DTT | Fluka | 43815 | ||
Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
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