Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.
Abstract
Het actine cytoskelet in de cel is een netwerk van actine filamenten die de beweging van cellen en cellulaire processen toelaat, en dat genereert spanning en helpt behoudt cellulaire vorm. Hoewel het actine cytoskelet is een rigide structuur, het is een dynamische structuur die constant is remodeling. Een aantal van de eiwitten kunnen binden aan het actine cytoskelet. De binding van een bepaald eiwit tot F-actine is vaak gewenst is om celbiologische waarnemingen te ondersteunen of om verder te begrijpen dynamische processen als gevolg van verbouwing van het actine cytoskelet. De actine co-sedimentatie assay is een in vitro test routinematig gebruikt om de binding van specifieke eiwitten of eiwit-domeinen met een F-actine te analyseren. De uitgangspunten van de test gepaard gaan met een incubatie van het eiwit van belang (volledige lengte of het domein van) met F-actine, ultracentrifugatie stap naar pellet F-actine en analyse van het eiwit co-sedimenting met F-actine. Actine co-sedimentatie testen kunnen daarom worden ontworpen om actine bindingsaffiniteiten en in concurrentie testen te meten.
Protocol
1. De voorbereiding van actine De bron van actine die in deze test was niet-spier menselijke bloedplaatjes (β-actine) verkregen van cytoskelet Inc Stock fracties bij 10 mg / ml worden bewaard in de -70 º C vriezer. Voor de test, is het actine verdund tot 0,4 mg / ml in een buffer die 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP en 0,5 mM DTT, gecentrifugeerd bij 20.000 g gedurende 10 minuten bij 4 º C. De bovenstaande vloeistof, die wordt monomere actine is klaar om te worden gepolyme…
Discussion
Actine co-sedimentatie is een eenvoudig in vitro test op specfic eiwitten binden aan F-actine te analyseren. In deze video, tonen we een voorbeeld van hoe een eenvoudige actine co-sedimentatie kan worden uitgevoerd. Laten we zien hoe F-actine te bereiden, voor te bereiden het eiwit te testen en de procedure van actine co-sedimentatie. Een aantal punten moet worden overwogen wanneer het uitvoeren van actine co-sedimentatie assays. Zo kan de buffer componenten voor de incubatie variëren, afhankelijk van het eiwit te worden getest en pH, temp…
Acknowledgements
Dank aan dr. Praveen Kumar in de Wittman lab aan de UCSF voor de film van actine in HaCAT cellen.
Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).
Srivastava, J., Barber, D. Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin. J. Vis. Exp. (13), e690, doi:10.3791/690 (2008).