투명 제브라피시 배아에서 종양 이종 이식 분석을 위한 간단하고 빠르며 효과적인 방법
Summary
우리는 간단하고 빠른 병기 결정 방법으로 최적화된 투명한 제브라피시 배아의 난황에 이종 이식을 위한 프로토콜을 설명합니다. 주입 후 분석에는 생존 및 유세포 분석을 통한 이종 이식 세포의 질병 부담 평가가 포함됩니다.
Abstract
종양 행동에 대한 생체 내 연구는 암 연구의 필수 요소입니다. 그러나 마우스의 사용은 비용과 시간면에서 상당한 문제를 야기합니다. 여기에서는 애벌레 제브라피시를 쥐 모델에 비해 취급 용이성, 저렴한 비용, 짧은 실험 기간 등 많은 장점이 있는 이식 모델로 제시합니다. 더욱이, 유충 단계에서 적응 면역 체계가 없기 때문에 면역 결핍 균주를 생성하고 사용할 필요가 없습니다. 제브라피시 배아에서 이종 이식을 위한 확립된 프로토콜이 존재하지만, 여기서는 더 빠른 전달을 위한 배아 병기 결정, 생존 분석 및 질병 부담을 평가하기 위한 유세포 분석의 사용과 관련된 개선된 방법을 제시합니다. 배아는 유충의 난황에 빠른 세포 주입을 용이하게 하고 주입된 세포 볼루스의 일관성을 모니터링하기 위해 세포 마킹을 촉진하기 위해 병기를 결정합니다. 주입 후, 배아 생존 분석은 주입 후 최대 7일(dpi)까지 평가됩니다. 마지막으로, 형광 단백질로 전달된 세포를 마킹하고 유세포 분석으로 분석하여 질병 부담을 평가합니다. 유세포 분석은 제브라피시 배아에서 세포 현탁액을 준비하는 표준화된 방법을 통해 가능하며, 이는 제브라피시 세포의 1차 배양을 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 요약하면, 여기에 설명된 절차를 사용하면 연구 군당 더 많은 수의 동물을 대상으로 생체 내 종양 세포의 거동을 보다 신속하게 평가할 수 있으며 보다 비용 효율적인 방식으로 수행할 수 있습니다.
Introduction
생체 내에서 유전자 변형 또는 약물 치료에 반응하는 종양의 거동 분석은 암 연구의 필수 요소입니다 1,2,3,4. 이러한 연구는 대부분 면역력이 저하된 마우스(Mus musculus) 모델5의 사용을 포함한다. 그러나 마우스에 대한 이종 이식 연구는 제한된 용량, 연장된 기간, 상당한 비용 및 내부 종양의 진행을 모니터링하기 위한 정교한 이미징 장비의 요구 사항을 포함하여 여러 측면에서 제한적입니다 6,7. 이와는 대조적으로, 제브라피시 모델(Danio rerio)은 더 큰 용량, 더 짧은 기간, 더 낮은 비용, 그리고 투명성으로 인해 질병 진행에 대한 간단한 모니터링을 가능하게 한다 8,9.
제브라피쉬는 자궁 외에서 발달하고 번식력이 높은 잘 발달된 척추동물 모델 시스템으로, 개별 암컷은 100개 이상의 배아를 생산한다10. 또한 제브라피시 배아는 투명하여 리포터와 같은 형광 관련 기술을 사용하여 발달 과정을 쉽게 시각화할 수 있습니다. 마지막으로, 중요한 발달 과정의 보존은 이식된 악성 세포의 행동을 포함한 많은 유형의 연구에 이상적인 모델이 됩니다11,12. 야생형 제브라피시 배아는 멜라닌 세포를 발달시켜 생후 2주가 되면 광학적으로 불투명하게 만들지만, 이는 캐스퍼 배아의 생성에 의해 극복되었습니다(RoyA9; MITFAW2), 평생 동안 투명하게 유지됩니다13. 그들의 광학적 특성 때문에, 캐스퍼 제브라피쉬는 이식된 종양 세포의 이상적인 수용체이다 14,15,16. 종양 세포를 제브라피쉬에 이종이식하는 것은 지난 2년 동안 중요성을 얻었습니다 17,18,19,20,21. 제브라피시 배아는 선천성 면역을 가지고 있습니다. 그러나 유충 단계에서는 적응 면역이 부족하여 기능적으로 면역력이 저하되어 이식된 종양 이종이식의 효과적인 숙주 역할을 할 수 있습니다22.
제브라피시 배아뿐만 아니라 성체의 종양 생착을 위한 프로토콜이 개발되었으며, 여러 가지 다른 변수를 고려했습니다 23,24,25,26,27. 이들은 제브라피쉬의 수많은 종양 침착 부위를 조사했으며, 여기에는 난황, 유리관 주위 공간 및 심장에 주입하는 것과 다양한 발달 단계가 포함된다16,28. 제브라피시 이종이식의 경우 제브라피시 사육은 일반적으로 28°C에서 이루어지는 반면 포유류 세포는 37°C에서 성장하기 때문에 양식의 주변 온도도 중요합니다. 결과적으로, 어류가 견딜 수 있으면서도 종양 성장을 지원하는 절충 온도를 사용해야 하며, 34°C는 두 가지 목표를 모두 달성하는 것으로 보인다29. 이종 이식 후 종양의 행동 및 진행을 분석하는 것은 또 다른 주요 초점 영역이며, 여기에는 생존 분석뿐만 아니라 다양한 이미징 양식의 사용이 포함됩니다30. 제브라피시 모델의 주요 장점 중 하나는 종양 행동에 대한 생체 내 연구에 엄청난 통계적 힘을 제공하기 위해 많은 수의 연구 동물을 사용할 수 있다는 것입니다. 그러나 이전 접근 방식은 주입을 위한 지루한 장착 절차가 필요하기 때문에 이러한 잠재력을 심각하게 제한했습니다.
여기에서는 투명한 캐스퍼 제브라피시 라인을 사용하여 높은 처리량과 주입 품질을 모니터링할 수 있는 간단하고 빠른 배아 선별 방법의 개발을 통해 이러한 한계를 해결합니다. 이것은 수정 후 2일(dpf)에 캐스퍼 제브라피시 배아의 난황낭에 이종이식편을 주입하는 것을 수반합니다. 우리는 종양 행동 분석의 일환으로 이종 이식 후 배아의 생존을 관찰합니다. 또한 이종 이식 후 단일 세포 현탁액을 만들고 유세포 분석법으로 분석하여 질병 부담을 평가하는 방법을 보여줍니다(그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
제브라피시 이종 이식은 마우스 연구에 대한 빠르고 강력하며 비용 효율적인 대안으로 부상했습니다12. 제브라피시 이종 이식에 대한 몇 가지 접근 방식이 보고되었지만, 우리의 적응은 상당한 개선을 가져왔습니다. 절차와 관련된 매개변수를 표준화하는 것 외에도 이러한 개선은 특히 종양 주입을 수행할 수 있는 속도를 가속화하는 데 중점을 두어 연구 그룹당 동물 수를 늘리?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 R37AI110985 및 P30CA006927, Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society 및 Bishop Fund의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 세포 배양, 유세포 분석 및 실험실 동물 시설을 포함한 Fox Chase의 핵심 시설의 지원을 받았습니다. FCCC에서 제브라피시 및 미세주사 시설을 유지해 주신 Jennifer Rhodes 박사님께 감사드립니다.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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