Eine einfache, schnelle und effektive Methode zur Analyse der Tumor-Xenotransplantation in transparenten Zebrafischembryonen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Xenotransplantation in das Eigelb von transparenten Zebrafischembryonen, das durch eine einfache, schnelle Staging-Methode optimiert wird. Die Analysen nach der Injektion umfassen das Überleben und die Beurteilung der Krankheitslast von xenotransplantierten Zellen durch Durchflusszytometrie.
Abstract
In-vivo-Studien zum Tumorverhalten sind ein Grundpfeiler der Krebsforschung; Der Einsatz von Mäusen stellt jedoch erhebliche Herausforderungen in Bezug auf Kosten und Zeit dar. Hier stellen wir den larvalen Zebrafisch als Transplantationsmodell vor, das zahlreiche Vorteile gegenüber Mausmodellen hat, darunter einfache Handhabung, geringe Kosten und kurze Versuchsdauer. Darüber hinaus macht das Fehlen eines adaptiven Immunsystems während der Larvenstadien die Notwendigkeit überflüssig, immundefiziente Stämme zu erzeugen und zu verwenden. Während es etablierte Protokolle für die Xenotransplantation in Zebrafischembryonen gibt, stellen wir hier eine verbesserte Methode vor, die das Embryo-Staging für einen schnelleren Transfer, die Überlebensanalyse und den Einsatz von Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Krankheitslast umfasst. Die Embryonen werden in Stadien gesetzt, um eine schnelle Zellinjektion in das Eigelb der Larven und eine Zellmarkierung zu ermöglichen, um die Konsistenz des injizierten Zellbolus zu überwachen. Nach der Injektion wird die Überlebensanalyse des Embryos bis zu 7 Tage nach der Injektion (dpi) bewertet. Schließlich wird auch die Krankheitslast durch Markierung übertragener Zellen mit einem fluoreszierenden Protein und Analyse mittels Durchflusszytometrie bewertet. Die Durchflusszytometrie wird durch eine standardisierte Methode zur Herstellung von Zellsuspensionen aus Zebrafischembryonen ermöglicht, die auch bei der Etablierung der Primärkultur von Zebrafischzellen verwendet werden könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Verfahren eine schnellere Beurteilung des Verhaltens von Tumorzellen in vivo mit einer größeren Anzahl von Tieren pro Studienarm und auf kostengünstigere Weise ermöglicht.
Introduction
Die Analyse des Verhaltens von Tumoren als Reaktion auf genetische Veränderungen oder medikamentöse Behandlung in vivo ist ein wesentliches Element der Krebsforschung 1,2,3,4. Solche Studien beinhalten meist die Verwendung von immungeschwächten Mausmodellen (Mus musculus)5; Xenotransplantationsstudien an Mäusen sind jedoch in vielerlei Hinsicht begrenzt, einschließlich begrenzter Kapazitäten, längerer Dauer, erheblicher Kosten und des Bedarfs an hochentwickelten Bildgebungsgeräten zur Überwachung des Fortschreitens interner Tumoren 6,7. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Zebrafischmodell (Danio rerio) eine höhere Kapazität, eine kürzere Dauer, geringere Kosten und aufgrund seiner Transparenz eine einfache Überwachung des Krankheitsverlaufs 8,9.
Der Zebrafisch ist ein gut entwickeltes Wirbeltiermodellsystem mit Ex-utero-Entwicklung und hoher Fruchtbarkeit, wobei einzelne Weibchen mehr als 100 Embryonen produzieren10. Darüber hinaus sind Zebrafischembryonen transparent, was eine einfache Visualisierung von Entwicklungsprozessen mit Hilfe von Fluoreszenztechniken wie Reportern ermöglicht. Schließlich macht die Konservierung kritischer Entwicklungsprozesse sie zu einem idealen Modell für viele Arten von Studien, einschließlich des Verhaltens transplantierter maligner Zellen 11,12. Wildtyp-Zebrafischembryonen entwickeln Melanozyten, die sie im Alter von 2 Wochen optisch undurchsichtig machen, was jedoch durch die Erzeugung von Casper-Embryonen überwunden wurde (RoyA9; mitfaw2), die ein Leben lang transparent bleiben13. Aufgrund ihrer optischen Eigenschaften sind Casper-Zebrafische ideale Empfänger von transplantierten Tumorzellen 14,15,16. Die Xenotransplantation von Tumorzellen in Zebrafische hat in den letzten 2 Jahrzehnten an Bedeutung gewonnen 17,18,19,20,21. Zebrafischembryonen haben eine angeborene Immunität; Ihnen fehlt jedoch während ihres Larvenstadiums eine adaptive Immunität, wodurch sie funktionell immungeschwächt sind, was es ihnen ermöglicht, als effektive Wirte für transplantierte Tumor-Xenotransplantate zu dienen22.
Für die Tumortransplantation in Zebrafischembryonen sowie bei Erwachsenen wurden Protokolle entwickelt, die eine Reihe verschiedener Variablen berücksichtigen 23,24,25,26,27. Diese haben zahlreiche Stellen der Tumorablagerung im Zebrafisch untersucht, darunter Injektionen in das Dotter, den perivitellinischen Raum und das Herz und in verschiedenen Entwicklungsstadien 16,28. Die Umgebungstemperatur der Aquakultur für Zebrafisch-Xenotransplantate ist ebenfalls wichtig, da die Aufzucht von Zebrafischen in der Regel bei 28 °C erfolgt, während die Säugetierzellen bei 37 °C wachsen. Folglich muss eine Kompromisstemperatur gewählt werden, die von den Fischen toleriert wird, aber das Tumorwachstum unterstützt, und 34 °C scheinen beide Ziele zu erreichen29. Die Analyse des Verhaltens und der Progression von Tumoren nach Xenotransplantation ist ein weiterer wichtiger Schwerpunkt, der den Einsatz einer Vielzahl von bildgebenden Verfahren sowie die Überlebensanalyse umfasst30. Einer der Hauptvorteile des Zebrafischmodells ist die Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Versuchstieren, die eine immense statistische Aussagekraft für In-vivo-Studien des Tumorverhaltens bieten. Bisherige Ansätze haben dieses Potenzial jedoch stark eingeschränkt, da langwierige Montageverfahren für Injektionen erforderlich sind.
Hier beheben wir diese Einschränkung durch die Entwicklung einer einfachen, schnellen Methode zur Stadierung von Embryonen, die einen hohen Durchsatz und eine Überwachung der Injektionsqualität mit der transparenten Casper-Zebrafischlinie ermöglicht. Dabei werden Xenotransplantate 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) in den Dottersack der Casper-Zebrafischembryonen injiziert. Wir beobachten das Überleben von Embryonen nach Xenotransplantation im Rahmen der Tumorverhaltensanalyse. Des Weiteren zeigen wir die Abschätzung der Krankheitslast nach Xenotransplantation durch die Herstellung von Einzelzellsuspensionen und die Analyse mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zebrafisch-Xenotransplantation hat sich als schnelle, robuste und kostengünstige Alternative zu Mausstudien erwiesen12. Obwohl über mehrere Ansätze zur Zebrafisch-Xenotransplantation berichtet wurde, hat unsere Anpassung zu signifikanten Verbesserungen geführt. Neben der Standardisierung der Parameter rund um das Verfahren konzentrieren sich diese Verbesserungen insbesondere auf die Beschleunigung der Geschwindigkeit, mit der Tumorinjektionen durchgeführt werden können, um so eine Erhöh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R37AI110985 und P30CA006927, eine Zuwendung des Commonwealth of Pennsylvania, der Leukemia and Lymphoma Society und des Bishop Fund unterstützt. Diese Studie wurde auch von den Kerneinrichtungen von Fox Chase unterstützt, einschließlich der Zellkultur, der Durchflusszytometrie und der Labortiereinrichtung. Wir danken Dr. Jennifer Rhodes für die Instandhaltung der Zebrafisch- und Mikroinjektionsanlage am FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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