Multipleks siklik immünohistokimya, tekrarlanan antijen-antikor inkübasyonu, görüntü taraması ve görüntü hizalama ve entegrasyonu kullanılarak aynı anda birden fazla belirtecin in situ tespitine izin verir. Burada, akciğer kanseri ve eşleştirilmiş beyin metastazı örneklerinde bu teknoloji ile immün hücre substratlarının tanımlanması için çalışma protokolünü sunuyoruz.
Tümör mikroçevresi, konakçı hücreler, tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri, stromal hücreler ve vaskülatür arasındaki etkileşimleri içerir. İmmün hücre alt kümelerinin ve hedef proteinlerin karakterize edilmesi ve uzamsal olarak düzenlenmesi prognostik ve terapötik amaçlar için çok önemlidir. Bu durum çoğullanmış immünohistokimya boyama yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Multipleks floresan immünohistokimyası, hücre fonksiyonunun ve hücreler arası etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını kolaylaştırarak çoklu belirteçlerin aynı anda saptanmasına izin verir. Bu yazıda, multipleks siklik floresan immünohistokimya testi için bir iş akışı ve lenfosit alt kümelerinin kantitifikasyon analizinde uygulanması açıklanmaktadır. Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama, antijen alımı, siklik antikor inkübasyonu ve formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) bir doku lamı üzerinde boyamayı içeren standart immünohistokimya ile benzer adımları ve reaktifleri takip eder. Antijen-antikor reaksiyonu sırasında, farklı türlerden bir antikor karışımı hazırlanır. Antijen alma süresi ve antikor konsantrasyonu gibi koşullar, sinyal-gürültü oranını artırmak için optimize edilir ve doğrulanır. Bu teknik tekrarlanabilir ve immünoterapi araştırmaları ve klinik uygulamalar için değerli bir araç olarak hizmet eder.
Beyin metastazları (BM), küçük hücreli dışı akciğer kanseri vakalarının (KHDAK) yaklaşık yarısında meydana gelen ve kötü prognozlu en yaygın merkezi sinir sistemi (MSS) tümörlerini temsil eder1. KHDAK hastalarının tahminen %10-20’si ilk tanı sırasında zaten BM’ye sahiptir ve KHDAK vakalarının yaklaşık %40’ında tedavi sırasında KHDAK gelişecektir2. Tümör mikroçevresi (TME), kan damarları, fibroblastlar, makrofajlar, hücre dışı matriks (ECM), lenfoid, kemik iliği kaynaklı bağışıklık hücreleri ve sinyal molekülleri gibi çeşitli bileşenler dahil olmak üzere NSCLC oluşumu ve BM ile yakından ilişkilidir 3,4. Mikroçevresel bağışıklık hücreleri, kanser hücresi büyümesini ve gelişimini etkilemede çok önemli bir rol oynar. Beyin metastazları, karmaşık immünolojik mikroortamlar ve sinyalizasyon süreçleri ile karakterize çok sayıda potansiyel tedavi hedefi sunar. Örneğin, PD-1 inhibitörleri, bir bağışıklık kontrol noktası inhibitörü (ICI) olarak akciğer kanseri beyin metastazı (LCBM) olan hastalar için klinik etkinlik göstermiştir. Bununla birlikte, PD-1 tedavisine yanıtların sıklığı primer KHDAK ve LCBM5 arasında değişir, bu da tümör immün mikroçevresinin kritik bir ICI düzenleyici görevi gördüğünü düşündürür.
İmmünohistokimya (IHC) biyoloji, temel tıp ve patoloji alanlarında paha biçilmez bir araçtır6. Bu tespit yöntemi, bir doku lamı7 üzerindeki antijen-antikorun etkileşimi yoluyla antijen ekspresyonunu görselleştirir. IHC, prediktif belirteçleri teşhis etmek, prognostik belirteçleri değerlendirmek, hedefe yönelik tedavileri yönlendirmek ve tümör hücrelerinin biyolojik işlevlerini araştırmak için kullanılır8. Bununla birlikte, geleneksel IHC yöntemi bir seferde yalnızca bir biyobelirteç tespit edebilir. Bu sınırlamayı ele almak için, immünohistokimyasal teknolojinin yeniliği, hem parlak alanda hem de floresan alanda aynı doku lamı üzerinde birden fazla protein belirtecinin aynı anda tanımlanmasına izin veren multipleks floresan immünohistokimyasının (mfIHC) geliştirilmesine yol açmıştır9. Bu ilerleme, TME içindeki stromal hücreler, bağışıklık hücreleri ve kanser hücreleri arasındaki hücre bileşiminin ve moleküler etkileşimlerin doğru analizini sağlar.
Bu çalışmada, immün hücrelerin mekansal dağılımını analiz etmek için multipleks siklik immünohistokimya için bir protokol sunuyoruz. Tavşan ve sıçan gibi farklı türlerin iki birincil antikoru aynı anda inkübasyon için seçilir, ardından floresan etiketli ikincil antikorlar gelir. Antijen alımı, her antijen-antikor reaksiyonu turundan sonra gerçekleştirilir. Otofloresan bloke edilir ve çekirdekleri boyamak için 4′, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanılır. Panel, CD3, CD8, CD20 ve CK’nin sıralı tespitini içerir, hücreler belirteçlere göre kategorize edilir: tümör hücreleri (CK +), olgun T hücreleri (CD3 +), sitotoksik T hücreleri (CD3 + CD8 +), B hücreleri (CD20 +) 10,11.
Multipleks siklik floresan immünohistokimya boyama sürecini tanımladık. Primer antikor seçimi, floresan immünohistokimya testinin çok önemli bir yönüdür ve daha iyi özgüllük ve tekrarlanabilirlik için monoklonal antikorlar önerilir. Primer antikorun çalışma konsantrasyonunu optimize etmek için, immünohistokimya deneyleri yoluyla bir dizi seyreltme test edilmiştir. Hem pozitif kontroller (hedef antijen ekspresyonunu değerlendirmek için) hem de negatif kontroller (primer antikor inkübasyonu yok) es…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NO.81860413, 81960455), Yunnan Bilim ve Teknoloji Departmanı Fonu (202001AY070001-080), Yunnan Eyaleti Eğitim Departmanı Bilimsel Araştırma Vakfı (2019J1274) tarafından desteklenmiştir.
0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
DAPI | sig-ma | D8417 | |
ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
slide viwer | 3D histech Ltd | ||
xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |