אימונוהיסטוכימיה מחזורית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי באתרו של סמנים מרובים בו זמנית באמצעות דגירה חוזרת של נוגדני אנטיגן, סריקת תמונה ויישור תמונה ואינטגרציה. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הפעולה לזיהוי מצעי תאי מערכת החיסון בטכנולוגיה זו בסרטן ריאות ובדגימות גרורות מוחיות זוגיות.
המיקרו-סביבה של הגידול כוללת אינטראקציות בין תאים מארחים, תאי גידול, תאי חיסון, תאי סטרומה וכלי דם. אפיון וארגון מרחבי של תת-קבוצות תאי חיסון וחלבוני מטרה חיוניים למטרות פרוגנוסטיות וטיפוליות. זה הוביל לפיתוח של שיטות צביעה immunohistochemistry multiplexed. אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מולטיפלקס מאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים מרובים, מה שמקל על הבנה מקיפה של תפקוד התא ואינטראקציות בין-תאיות. במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה עבור בדיקת אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מחזורית מרובת מחזורים ויישומה בניתוח הכימות של תת-קבוצות לימפוציטים. צביעת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית המחזורית המרובבת עוקבת אחר שלבים וריאגנטים דומים לאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית, וכוללת שליפת אנטיגן, דגירה מחזורית של נוגדנים וצביעה על שקופית רקמה משובצת פרפין קבועה פורמלין (FFPE). במהלך תגובת האנטיגן-נוגדנים מכינים תערובת של נוגדנים ממינים שונים. תנאים, כגון זמן אחזור אנטיגן וריכוז נוגדנים, ממוטבים ומאומתים כדי להגדיל את יחס האות לרעש. טכניקה זו ניתנת לשחזור ומשמשת כלי רב ערך למחקר אימונותרפיה וליישומים קליניים.
גרורות במוח (BM) מייצגות את הגידולים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתרחשים בכמעט מחצית ממקרי סרטן הריאה של תאים לא קטנים (NSCLC), עם פרוגנוזה גרועה1. על פי הערכות, ל-10%-20% מחולי NSCLC כבר יש BM בזמן האבחנה הראשונית, וכ-40% ממקרי NSCLC יפתחו BM במהלך הטיפול2. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) קשורה קשר הדוק עם התרחשות NSCLC ו-BM, כולל רכיבים שונים, כגון כלי דם, פיברובלסטים, מקרופאגים, מטריצה חוץ-תאית (ECM), לימפואיד, תאים חיסוניים שמקורם במח עצם ומולקולות איתות 3,4. תאי חיסון מיקרו-סביבתיים ממלאים תפקיד מכריע בהשפעה על גדילה והתפתחות של תאים סרטניים. גרורות במוח מציגות מטרות טיפול פוטנציאליות רבות המאופיינות במיקרו-סביבות אימונולוגיות מורכבות ובתהליכי איתות. לדוגמה, מעכבי PD-1 הראו יעילות קלינית עבור חולים עם גרורות במוח של סרטן ריאות (LCBM) כמעכב מחסום חיסוני (ICI). עם זאת, תדירות התגובות לטיפול ב-PD-1 משתנה בין NSCLC ראשוני ל-LCBM5, מה שמרמז על כך שהמיקרו-סביבה החיסונית של הגידול פועלת כמווסת ICI קריטי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא כלי רב ערך בתחומי הביולוגיה, רפואת היסוד והפתולוגיה6. שיטת זיהוי זו ממחישה ביטוי אנטיגן באמצעות אינטראקציה של נוגדן אנטיגן על שקופיתרקמה 7. IHC משמש לאבחון סמנים מנבאים, הערכת סמנים פרוגנוסטיים, הנחיית טיפולים ממוקדים וחקירת התפקודים הביולוגיים של תאי גידול8. עם זאת, שיטת IHC המסורתית יכולה לזהות רק סמן ביולוגי אחד בכל פעם. כדי להתמודד עם מגבלה זו, החדשנות של הטכנולוגיה האימונוהיסטוכימית הובילה לפיתוח אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מרובת משתתפים (mfIHC), המאפשרת זיהוי סימולטני של סמנים חלבוניים מרובים על אותה שקופית רקמה, הן בשדה בהיר והן בשדה פלואורסצנטי9. התקדמות זו מספקת ניתוח מדויק של הרכב התאים והאינטראקציות המולקולריות בין תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון ותאי סרטן בתוך TME.
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה מחזורית מרובת משתתפים לניתוח ההתפלגות המרחבית של תאי מערכת החיסון. שני נוגדנים ראשוניים ממינים שונים, כגון ארנב וחולדה, נבחרים לדגירת דגירה בו זמנית, ולאחר מכן נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנטיות. שליפת אנטיגן מתבצעת לאחר כל סבב של תגובת אנטיגן-נוגדנים. אוטופלואורסצנטיות חסומה, ו-4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) משמש להכתמת הגרעינים. הפאנל כולל זיהוי רציף של CD3, CD8, CD20 ו- CK, תאים מסווגים לפי הסמנים: תאי גידול (CK+), תאי T בוגרים (CD3+), תאי T ציטוטוקסיים (CD3+CD8+), תאי B (CD20+)10,11.
תיארנו את התהליך של צביעה אימונוהיסטוכימית פלואורסצנטית מחזורית מרובה. בחירת הנוגדנים הראשונית היא היבט מכריע של בדיקת האימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית, ונוגדנים חד-שבטיים מומלצים לספציפיות וחזרתיות טובות יותר. כדי לייעל את ריכוז העבודה של הנוגדן הראשוני, סדרה של דילולים נבדקו באמצעות …
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NO.81860413, 81960455), קרן מחלקת המדע והטכנולוגיה של יונאן (202001AY070001-080), קרן המחקר המדעי של מחלקת החינוך של מחוז יונאן (2019J1274).
0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
DAPI | sig-ma | D8417 | |
ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
slide viwer | 3D histech Ltd | ||
xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |