Мультиплексная циклическая иммуногистохимия позволяет in situ обнаруживать несколько маркеров одновременно с помощью повторной инкубации антиген-антитело, сканирования изображений, выравнивания и интеграции изображений. Здесь мы представляем операционный протокол идентификации субстратов иммунных клеток с помощью этой технологии в образцах рака легких и парных метастазов в головном мозге.
Микроокружение опухоли включает в себя взаимодействие между клетками хозяина, опухолевыми клетками, иммунными клетками, стромальными клетками и сосудистой сетью. Характеристика и пространственная организация субпопуляций иммунных клеток и белков-мишеней имеют решающее значение для прогностических и терапевтических целей. Это привело к разработке мультиплексных иммуногистохимических методов окрашивания. Мультиплексная флуоресцентная иммуногистохимия позволяет одновременно обнаруживать несколько маркеров, способствуя всестороннему пониманию функции клеток и межклеточных взаимодействий. В данной работе описывается рабочий процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического анализа и его применение в количественном анализе субпопуляций лимфоцитов. Мультиплексное циклическое флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание проходит те же этапы и реагенты, что и стандартная иммуногистохимия, включая извлечение антигена, циклическую инкубацию антител и окрашивание на предметном стекле ткани, закрепленном формалином и парафином (FFPE). Во время реакции антиген-антитело готовится смесь антител разных видов. Такие условия, как время извлечения антигена и концентрация антител, оптимизируются и проверяются для увеличения отношения сигнал/шум. Этот метод воспроизводим и служит ценным инструментом для исследований в области иммунотерапии и клинического применения.
Метастазы в головной мозг (БМ) представляют собой наиболее распространенные опухоли центральной нервной системы (ЦНС), встречающиеся почти в половине случаев немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) с неблагоприятным прогнозом1. По оценкам, 10–20% пациентов с НМРЛ уже имеют БМ на момент постановки первоначального диагноза, и примерно у 40% пациентов с НМРЛ БМ развивается в течение курса лечения2. Микроокружение опухоли (ТМЭ) тесно связано с возникновением НМРЛ и БМ, включая различные компоненты, такие как кровеносные сосуды, фибробласты, макрофаги, внеклеточный матрикс (ВКМ), лимфоидные иммунные клетки, иммунные клетки костного мозга и сигнальные молекулы 3,4. Иммунные клетки микроокружения играют решающую роль во влиянии на рост и развитие раковых клеток. Метастазы в головном мозге представляют собой многочисленные потенциальные мишени для лечения, характеризующиеся сложным иммунологическим микроокружением и сигнальными процессами. Например, ингибиторы PD-1 показали клиническую эффективность у пациентов с метастазами рака легких в головной мозг (ЛКМ) в качестве ингибитора контрольных точек иммунного ответа (ИКТИ). Тем не менее, частота ответов на терапию PD-1 варьируется между первичным НМРЛ и LCBM5, что позволяет предположить, что опухолевое иммунное микроокружение действует как важнейший регулятор ICI.
Иммуногистохимия (ИГХ) является бесценным инструментом в области биологии, фундаментальной медицины и патологии6. Этот метод детекции визуализирует экспрессию антигена через взаимодействие антиген-антитело на предметном стеклеткани 7. ВПХ используется для диагностики прогностических маркеров, оценки прогностических маркеров, назначения таргетной терапии и изучения биологических функций опухолевых клеток8. Однако традиционный метод ВПХ может обнаружить только один биомаркер за раз. Чтобы устранить это ограничение, инновация иммуногистохимической технологии привела к разработке мультиплексной флуоресцентной иммуногистохимии (mfIHC), которая позволяет одновременно идентифицировать несколько белковых маркеров на одном и том же предметном стекле ткани, как в светлом, так и во флуоресцентном поле9. Это достижение обеспечивает точный анализ клеточного состава и молекулярных взаимодействий между стромальными клетками, иммунными клетками и раковыми клетками в пределах TME.
В данном исследовании представлен протокол мультиплексной циклической иммуногистохимии для анализа пространственного распределения иммунных клеток. Для инкубации одновременно выбираются два первичных антитела разных видов, таких как кролик и крыса, за которыми следуют флуоресцентно меченные вторичные антитела. Забор антигена проводится после каждого раунда реакции антиген-антитело. Аутофлуоресценция блокируется, и для окрашивания ядер используется 4′, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Панель включает последовательное определение CD3, CD8, CD20 и КФК, клетки классифицируются по маркерам: опухолевые клетки (CK+), зрелые Т-клетки (CD3+), цитотоксические Т-клетки (CD3+CD8+), В-клетки (CD20+)10,11.
Описан процесс мультиплексного циклического флуоресцентного иммуногистохимического окрашивания. Первичный выбор антител является решающим аспектом флуоресцентного иммуногистохимического анализа, и моноклональные антитела рекомендуются для лучшей специфичности и воспроизводимо…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NO.81860413, 81960455), Фондом Юньнаньского департамента науки и технологий (202001AY070001-080), Научно-исследовательским фондом Департамента образования провинции Юньнань (2019J1274).
0.15 mol/L KmnO4 | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MST-8005 | |
100x sodium citrate | Maixin Biotechnology Co., Ltd | MVS-0100 | |
3% hydrogen peroxide | Maixin Biotechnology Co., Ltd | SP KIT-A1 | |
3D Pannoramic MIDI | 3D histech Ltd | Pannoramic MIDI 1.18 | |
Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150113 | |
Alexa Fluor 568 | Abcam | ab175701 | |
Alexa Fluor 594 | Abcam | ab150116 | |
Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150079 | |
Bond primary antibody diluent | Lecia | AR9352 | |
CD20 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | kit-0001 | |
CD3 | Maixin Biotechnology Co., Ltd. | kit-0003 | |
CD8 | Maixin Biotechnology Co., Ltd | RMA-0514 | |
CK | Maixin Biotechnology Co. Ltd. | MAB-0671, | |
DAPI | sig-ma | D8417 | |
ethanol | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10009218 | |
Histocore Multicut | lecia | 2245 | |
PBS(powder) | Maixin Biotechnology Co., Ltd | PBS-0061 | |
slide viwer | 3D histech Ltd | ||
xylene | Sinopharm Group Chemical reagent Co., LTD | 10023418 |