Preparación de una suspensión unicelular de arterias carótidas de ratón para la secuenciación de células individuales
Summary
Aquí describimos un protocolo de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de las arterias carótidas de ratón.
Abstract
Las arterias carótidas son vasos sanguíneos importantes en el cuello que suministran sangre y oxígeno al cerebro, pero la estenosis carotídea ocurre cuando las arterias carótidas están obstruidas por placa. Revelar la composición celular de la arteria carótida a nivel de una sola célula es esencial para tratar la aterosclerosis carotídea. Sin embargo, no existe un protocolo listo para usar para la preparación de suspensiones unicelulares de las arterias carótidas. Para obtener un protocolo adecuado para la disociación de las arterias carótidas normales a nivel unicelular con menos daño a las células, diseñamos un método de digestión en dos pasos mediante la integración del proceso de digestión de colagenasa/DNasa y tripsina. Se utilizó el recuento de doble fluorescencia de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) para detectar la viabilidad y concentración celular, y se encontró que la suspensión de una sola célula cumplía con los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Después del procesamiento de datos de una sola célula, se detectó una mediana de ~ 2500 transcripciones por célula en cada célula de la arteria carótida. En particular, se detectaron simultáneamente una variedad de tipos de células de la arteria carótida normal, incluidas las células del músculo liso vascular (CMV), los fibroblastos, las células endoteliales (CE) y los macrófagos y las células dendríticas (Mφ/DC). Este protocolo se puede aplicar para preparar una suspensión unicelular de vasos sanguíneos de otros tejidos con las modificaciones adecuadas.
Introduction
La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica asociada a factores de riesgo como hipertensión arterial, hiperlipidemia y hemodinámica1. Las bifurcaciones de las arterias carótidas son propensas a cambios hemodinámicos y conducen a la formación de placa carotídea. La presentación clínica de la aterosclerosis carotídea puede ser aguda, como el accidente cerebrovascular y la isquemia cerebral transitoria, o crónica, como la isquemia cerebral transitoria recurrente y la demencia vascular2. Mecánicamente, la placa carotídea es el resultado de la interacción entre diferentes células de la pared de los vasos y varias células sanguíneas en condiciones patológicas. Por lo tanto, revelar el atlas unicelular de los vasos carotídeos en condiciones fisiológicas y patológicas es particularmente importante para prevenir y tratar el desarrollo de la placa carotídea.
La secuenciación de ARN unicelular es una de las tecnologías más potentes de la investigación biológica debido a su ultra alta resolución y a la detección de la heterogeneidad celular del mismo tipo de células de organismos 3,4. Los investigadores han utilizado la secuenciación de ARN de una sola célula para realizar investigaciones en muchos campos, como las enfermedades cardiovasculares5 y el cáncer6. Sin embargo, separar los tejidos de forma rápida y precisa en células individuales sigue siendo uno de los principales desafíos. La disociación enzimática es un método de uso común que incluye predominantemente colagenasa, papaína, tripsina, DNasa e hialuronidasa. Específicamente, las colagenasas son las principales especies de enzimas para la digestión unicelular, principalmente hidrolizando los componentes de colágeno en los tejidos conectivos. Diferentes tipos de colagenasa son aplicables para la disociación de diferentes tejidos, como la glándula mamaria7, el glomérulo8, el ángulo iridocorneal9, la articulación de la rodilla10, la aorta 11 y el pulmón12. Debido a las propiedades fisiológicas únicas de los diferentes tejidos, la disociación utilizando el mismo método puede causar muchos problemas en la adquisición de células individuales, como baja viabilidad celular, bajo número de células y restos celulares grandes. Por lo tanto, la invención de métodos de digestión para diferentes tejidos es esencial para preparar suspensiones unicelulares de alta calidad.
Este protocolo tiene como objetivo desarrollar un método de digestión celular de dos pasos para preparar una suspensión unicelular de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje. De acuerdo con las características de la arteria carótida, combinamos colagenasa/DNasa con tripsina para obtener una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida del ratón, ya que la colagenasa puede hidrolizar el colágeno de los tejidos carotídeos, que luego fue digerido por la tripsina en una suspensión unicelular. Se utilizó el recuento de doble fluorescencia de naranja de acridina/yoduro de propidio (AO/PI) para detectar la viabilidad y concentración celular, y se encontró que la suspensión de una sola célula cumplía con los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Después del procesamiento de datos de una sola célula, se identificaron cuatro tipos de células, incluidas las células del músculo liso vascular (VSMC), los fibroblastos, las células endoteliales (CE) y los macrófagos y las células dendríticas (Mφ/DC), en las arterias carótidas normales del ratón después de la digestión. Las ventajas de este protocolo son que: 1) se pueden identificar múltiples tipos de células en la arteria carótida, 2) la viabilidad celular está bien conservada y 3) se puede repetir fácilmente sin equipo especial. Este protocolo es adecuado para investigadores que estén interesados en estudiar la multiómica unicelular de las arterias carótidas de ratón. Este protocolo también puede ser útil en la disociación de otros vasos sanguíneos con las modificaciones adecuadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad de la arteria carótida de ratones de tipo salvaje, en el que se construyó un método de digestión de dos pasos que integra el proceso de digestión de colagenasa/DNasa y tripsina. Tras el control de calidad de la suspensión unicelular, comprobamos que cumplía los requisitos para la secuenciación unicelular, con una viabilidad de células superior al 85% y una alta concentración celular. Además, una varie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (82070450 a C.T. y 82170466 a L.Z.) y la beca de la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (7121102223 a F.L.).
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
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