Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.
As artérias carótidas são os principais vasos sanguíneos do pescoço que fornecem sangue e oxigênio ao cérebro, mas a estenose carotídea ocorre quando as artérias carótidas são obstruídas por placas. Revelar a composição celular da artéria carótida em nível unicelular é essencial para o tratamento da aterosclerose carotídea. No entanto, não há um protocolo pronto para o uso para a preparação de suspensões unicelulares das artérias carótidas. Para obter um protocolo adequado para a dissociação das artérias carótidas normais em nível unicelular com menor dano às células, projetamos um método de digestão em duas etapas, integrando o processo de digestão da colagenase/DNase e tripsina. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após o processamento de dados de célula única, uma mediana de ~2500 transcritos por célula foi detectada em cada célula da artéria carótida. Notavelmente, uma variedade de tipos celulares da artéria carótida normal, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram detectadas simultaneamente. Este protocolo pode ser aplicado para preparar uma suspensão unicelular de vasos sanguíneos de outros tecidos com modificações apropriadas.
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada a fatores de risco como hipertensão arterial, hiperlipidemia ehemodinâmica1. As bifurcações da artéria carótida são propensas a alterações hemodinâmicas e levam à formação de placas carotídeas. A apresentação clínica da aterosclerose carotídea pode ser aguda, como acidente vascular cerebral e isquemia cerebral transitória, ou crônica, como isquemia cerebral transitória recorrente e demênciavascular2. Mecanicamente, a placa carotídea é o resultado da interação entre diferentes células da parede do vaso e várias células sanguíneas em condições patológicas. Portanto, revelar o atlas unicelular dos vasos carotídeos em condições fisiológicas e patológicas é particularmente importante para prevenir e tratar o desenvolvimento da placa carotídea.
O sequenciamento de RNA unicelular é uma das mais poderosas tecnologias de pesquisa biológica devido à sua resolução ultra-alta e detecção de heterogeneidade celular a partir de um mesmo tipo celular de organismos 3,4. Pesquisadores têm usado o sequenciamento de RNA de célula única para conduzir pesquisas em muitos campos, como doenças cardiovasculares5 e câncer6. No entanto, separar os tecidos em células isoladas de forma rápida e precisa ainda é um dos principais desafios. A dissociação enzimática é um método comumente usado que inclui predominantemente colagenase, papaína, tripsina, DNase e hialuronidase. Especificamente, as colagenases são as principais espécies enzimáticas para digestão unicelular, principalmente hidrolisando componentes do colágeno em tecidos conjuntivos. Diferentes tipos de colagenases são aplicáveis para a dissociação de diferentes tecidos, como glândulamamária7, glomérulo8, ângulo iridocorneano9, articulação do joelho 10, aorta11 e pulmão 12. Devido às propriedades fisiológicas únicas de diferentes tecidos, a dissociação usando o mesmo método pode causar muitos problemas na aquisição de células únicas, como baixa viabilidade celular, baixo número de células e grandes debris celulares. Portanto, a invenção de métodos de digestão para diferentes tecidos é essencial para a preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade.
Este protocolo visa desenvolver um método de digestão celular em duas etapas para preparar uma suspensão unicelular da artéria carótida de camundongos selvagens. De acordo com as características da artéria carótida, combinamos colagenase/DNase com tripsina para obter uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongo, pois a colagenase pode hidrolisar o colágeno dos tecidos carotídeos, que foi posteriormente digerido pela tripsina em uma suspensão unicelular. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após processamento de dados de célula única, quatro tipos celulares, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram identificados em artérias carótidas normais de camundongos após a digestão. As vantagens desse protocolo são que: 1) múltiplos tipos celulares na artéria carótida podem ser identificados, 2) a viabilidade celular está bem preservada e 3) pode ser facilmente repetida sem equipamento especial. Este protocolo é adequado para pesquisadores interessados em estudar a multiômica unicelular das artérias carótidas de camundongos. Este protocolo também pode ser útil na dissociação de outros vasos sanguíneos com modificações apropriadas.
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongos selvagens, no qual um método de digestão em duas etapas integrando o processo de digestão de colagenase/DNase e tripsina foi construído. Após a verificação de qualidade da suspensão de célula única, verificamos que ela satisfazia os requisitos para sequenciamento de célula única, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Além disso, …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Natural Science Foundation of China (82070450 para C.T. e 82170466 para L.Z.) e pela bolsa da China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 para F.L.).
0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |