在这里,我们描述了一种两步细胞消化方案,用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬浮液。
颈动脉是颈部的主要血管,为大脑提供血液和氧气,但当颈动脉被斑块堵塞时,就会发生颈动脉狭窄。在单细胞水平上揭示颈动脉的细胞组成对于治疗颈动脉粥样硬化至关重要。然而,目前尚无现成的方案用于制备颈动脉单细胞悬浮液。为了获得在单细胞水平上解离正常颈动脉且对细胞损伤较小的合适方案,我们设计了一种两步消化方法,通过整合胶原酶/DNase 和胰蛋白酶的消化过程。采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)双荧光计数检测细胞活力和浓度,发现单细胞悬液满足单细胞测序要求,细胞活力超过85%,细胞浓度高。单细胞数据处理后,在每个颈动脉细胞中检测到每个细胞的中位数~2500个转录本。值得注意的是,可同时检测到正常颈动脉的多种细胞类型,包括血管平滑肌细胞 (VSMC)、成纤维细胞、内皮细胞 (EC) 以及巨噬细胞和树突状细胞 (Mφ/DC)。该方案可用于制备具有适当修饰的来自其他组织的血管的单细胞悬浮液。
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,与高血压、高脂血症和血流动力学等危险因素有关1。颈动脉分叉容易发生血流动力学改变,导致颈动脉斑块形成。颈动脉粥样硬化的临床表现可以是急性的,如卒中和短暂性脑缺血,也可以是慢性的,如复发性短暂性脑缺血和血管性痴呆2。从机械上讲,颈动脉斑块是病理条件下不同血管壁细胞与各种血细胞相互作用的结果。因此,揭示生理和病理条件下的颈动脉血管单细胞图谱对于预防和治疗颈动脉斑块的发展尤为重要。
单细胞 RNA 测序是生物学研究中最强大的技术之一,因为它具有超高分辨率和检测来自相同细胞类型生物体的细胞异质性 3,4。研究人员使用单细胞RNA测序在许多领域进行研究,例如心血管疾病5和癌症6。然而,快速准确地将组织分离成单细胞仍然是主要挑战之一。酶解离是一种常用的方法,主要包括胶原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase 和透明质酸酶。具体来说,胶原酶是单细胞消化的主要酶种,主要水解结缔组织中的胶原成分。不同的胶原酶类型适用于不同组织的解离,如乳腺7、肾小球8、虹膜角角9、膝关节10、主动脉11、肺12。由于不同组织独特的生理特性,使用相同的方法解离可能会在获取单个细胞时造成许多麻烦,例如细胞活力低、细胞数量少、细胞碎片大等。因此,针对不同组织的消化方法的发明对于制备高质量的单细胞悬浮液至关重要。
该方案旨在开发一种两步细胞消化方法,以制备野生型小鼠颈动脉的单细胞悬浮液。根据颈动脉的特点,我们将胶原酶/DNase与胰蛋白酶联合使用,以获得高质量的小鼠颈动脉单细胞悬液,因为胶原酶可以水解颈动脉组织的胶原蛋白,颈动脉组织被胰蛋白酶进一步消化成单细胞悬浮液。采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)双荧光计数检测细胞活力和浓度,发现单细胞悬液满足单细胞测序要求,细胞活力超过85%,细胞浓度高。经过单细胞数据处理,在消化后的正常小鼠颈动脉中鉴定出血管平滑肌细胞(VSMCs)、成纤维细胞、内皮细胞(ECs)和巨噬细胞和树突状细胞(Mφ/DCs)等4种细胞类型。该协议的优点是:1)可以识别颈动脉中的多种细胞类型,2)细胞活力保存良好,3)无需特殊设备即可轻松重复。该协议适用于有兴趣研究小鼠颈动脉单细胞多组学的研究人员。该方案还可能有助于通过适当的修改解离其他血管。
在这里,我们提供了从野生型小鼠颈动脉制备高质量单细胞悬浮液的详细方案,其中构建了一种整合胶原酶/ DNase和胰蛋白酶消化过程的两步消化方法。经过对单细胞悬液的质量检查,我们发现它满足了单细胞测序的要求,细胞活力超过85%,细胞浓度高。此外,经过单细胞数据处理,成功检测到颈动脉中的多种细胞类型,包括VSMCs、成纤维细胞、ECs和Mφ/DCs。
目前制备颈动脉单?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了中国自然科学基金(82070450 to C.T.和 82170466 to L.Z.)和中国博士后科学基金(7121102223 to F.L.)的资助。
0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |