EV-ACT(Activated Clotting Time)를 사용한 세포외 소포(EV)의 응고 활성 측정
Summary
이 프로토콜은 EV의 응고 능력의 지표로 세포외 소포체(EV)가 풍부한 혈장의 사용을 조사합니다. EV가 풍부한 플라즈마는 차등 원심분리 및 후속 재석회화 과정을 통해 얻어집니다.
Abstract
다양한 질병에서 세포외 소포체(EV)의 역할은 특히 강력한 응고 활성으로 인해 점점 더 주목을 받고 있습니다. 그러나 임상 환경에서 EV의 응고 활성을 평가하기 위한 병상 검사가 시급히 필요합니다. 이 연구는 EV의 응고제 활성의 척도로 EV가 풍부한 혈장의 트롬빈 활성화 시간을 사용할 것을 제안합니다. 나트륨 구연산 전혈을 얻기 위해 표준화된 절차를 사용한 후 EV가 풍부한 혈장을 얻기 위해 차등 원심분리를 수행했습니다. EV가 풍부한 플라즈마와 염화칼슘을 테스트 컵에 첨가하고 분석기를 사용하여 점탄성의 변화를 실시간으로 모니터링했습니다. EV-ACT라고 하는 EV가 풍부한 혈장의 자연 응고 시간을 측정했습니다. 그 결과, 건강한 지원자로부터 얻은 혈장에서 EV를 제거했을 때 EV-ACT가 크게 증가한 반면, EV가 농축되었을 때 EV-ACT가 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, 자간전증, 고관절 골절 및 폐암의 인간 샘플에서 EV-ACT가 상당히 단축되어 혈장 EV 수치가 상승하고 혈액 과응고가 촉진되었음을 나타냅니다. 간단하고 빠른 시술을 통해 EV-ACT는 혈장 EV 수치가 높은 환자의 응고 기능을 평가하기 위한 병상 검사로서 가능성을 보여줍니다.
Introduction
혈액 응고 과잉에 의해 발생하는 혈전증은 뇌 외상(brain trauma)1, 자간전증(pre-eclampsia)2, 종양(tumors)3, 골절 환자(fracture patients)4 등 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다. 과응고성의 기전은 복잡하며, 최근에는 응고 장애에서 세포외 소포체(EV)의 역할이 강조되고 있습니다. EV는 직경이 10nm에서 1000nm에 이르는 세포막에서 분리되는 이중층 구조를 가진 소포 모양의 몸체입니다. 이는 다양한 질병 과정, 특히 응고 장애와 관련이 있다5. 여러 연구에서 EV가 혈전증 위험의 유망한 예측 인자로 확인되었습니다 6,7. EV의 응고 활성은 응고 인자, 주로 조직 인자(TF)와 포스파티딜세린(PS)의 발현에 따라 달라집니다. 강력한 프로응고제 활성을 가진 EV는 테나아제와 프로트롬빈 복합체의 촉매 효율을 크게 향상시켜 트롬빈 매개 피브리노겐과 국소 혈전증을 촉진한다8. EV의 높은 수준과 과응고성과의 인과 관계는 수많은 질병에서 관찰되었다9. 결과적으로, EV의 검출을 표준화하고 그들의 응고제 활성을 보고하는 것은 중요한 조사 영역이다10.
현재까지 EV의 응고 활성을 감지하는 데 사용할 수 있는 상용 키트는 소수에 불과합니다. 상업 회사에서 생산한 MP-활성 분석 및 MP-TF 분석은 혈장11에서 EV의 응고제 활성을 측정하는 데 사용되는 기능 분석입니다. 이 분석은 효소 결합 면역 흡착 분석과 유사한 원리를 사용하여 EV에서 PS 및 TF를 검출합니다. 그러나 이러한 키트는 비싸고 소수의 고급 연구 기관으로 제한됩니다. 이 프로세스는 복잡하고 시간이 많이 걸리기 때문에 임상 환경에서 구현하기가 어렵습니다. 또한, 상업적으로 개발된 프로코아응고제 인지질(PPL) 분석은 PS-free 혈장과 테스트 혈장을 혼합하여 응고 시간을 측정하여 PS 양성 EV의 수준을 정량적으로 검출한다12. 그러나 이러한 분석은 주로 EV의 PS 및 TF에 초점을 맞추고 순환 EV가12에 관여할 수 있는 다른 응고 경로를 간과합니다.
혈장 응고 시스템은 복잡하며 응고제, 항응고제, 섬유소 용해 시스템 및 혈장에 부유하는 EV를 포함하여 “보이지 않는” 구성 요소와 “보이는” 구성 요소로 구성됩니다. 생리학적으로 이러한 구성 요소는 동적 균형을 유지합니다. 병리학적 상태에서, 순환 중인 EV의 현저한 증가는 특히 뇌 외상, 자간전증, 골절 및 다양한 유형의 암 환자에서 과응고에 기여한다13. 현재 임상 실험실에서 응고 상태를 평가하는 것은 주로 응고 시스템, 항응고 시스템 및 섬유소 용해를 평가하는 것을 포함합니다 14,15,16,17. 프로트롬빈 시간, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간, 트롬빈 시간 및 국제 정규화 비율은 일반적으로 응고 시스템18에서 응고 인자 수준을 평가하는 데 사용된다. 그러나 최근 연구에 따르면 이러한 검사는 특정 질병의 과응고 가능성을 완전히 반영하지 못한다19. 혈전 탄성 측정법(TEG), 회전 TEG 및 소노클로트 분석과 같은 다른 분석 방법은 전혈 점탄성 변화를 측정합니다20,21. 전혈 샘플에는 수많은 혈액 세포와 혈소판이 포함되어 있기 때문에 이러한 검사는 샘플 전체의 응고 상태를 나타낼 가능성이 더 큽니다. 일부 연구자들은 혈액 세포와 혈소판이 응고제 활성에서 차지하는 역할에 대해 보고했습니다 22,23. 최근 연구에서는 이전의 응고 기능 검사가 미세입자의 응고 활성의 변화를 감지하는 데 어려움을 겪는다는 사실도 발견했다24. 따라서 EV가 풍부한 혈장에서 활성화된 응고 시간(ACT)의 점탄성 측정으로 EV의 응고 기능을 평가할 수 있다는 가설이 제안되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 EV가 풍부한 혈장의 제조를 설명하고 유세포 분석을 사용하여 방법의 합리성을 검증했습니다. 이어서, 재석회화된 혈장 샘플은 점탄성 원리24에 기초한 응고 분석기를 사용하여 ACT 시간 동안 분석하였다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 초원심분리를 통해 얻은 EV의 농도는 EV-ACT 시간을 단축하는 것으로 나타났으며, EV 수준을 감소시킨 초원심분리 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 81930031, 81901525)의 보조금으로 지원되었습니다. 또한 기계 및 기술 지침을 제공해 주신 Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.에 감사드립니다.
Materials
| AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles | 3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA | For quantitative detection of MP | |
| Calcium chloride | Werfen (china) | 0020006800 | 20 mM |
| Century Clot analyzer | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method | |
| Disposable probe and test cup | Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd | ||
| LSR Fortessa flow cytometer | BD, USA | Used to detect MP | |
| Megamix polystyrene beads | Biocytex, Marseille, France | 7801 | The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm. |
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