Avaliação Rápida da Citotoxicidade In Vitro do Receptor de Antígeno Quimérico Jurkat Expressando Usando Imagem Fluorescente
Summary
Um protocolo para avaliar a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat expressando receptor de antígeno quimérico (CAR) visando antígeno único tumoral. Este protocolo pode ser usado como uma plataforma de triagem para otimização rápida de construções de dobradiças CAR antes da confirmação em células T derivadas do sangue periférico.
Abstract
As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) estão na vanguarda da oncologia. Um CAR é construído de um domínio de alvo (geralmente um fragmento variável de cadeia única, scFv), com um elo intra-cadeia que o acompanha, seguido por uma dobradiça, transmembrana e domínio costimulatório. A modificação do domínio do elo intra-cadeia e da dobradiça pode ter um efeito significativo na matança mediada pelo CAR. Considerando as muitas opções diferentes para cada parte de uma construção CAR, há um grande número de permutações. Fazer células CAR-T é um processo demorado e caro, e fazer e testar muitas construções é um investimento pesado de tempo e material. Este protocolo descreve uma plataforma para avaliar rapidamente construções CAR otimizadas para dobradiças em células Jurkat (CAR-J). As células Jurkat são uma linhagem de células T imortalizadas com alta captação de lentivírus, permitindo uma transdução eficiente de CAR. Aqui, apresentamos uma plataforma para avaliar rapidamente o CAR-J usando um imageador fluorescente, seguido pela confirmação de citólise em células T derivadas do PBMC.
Introduction
A terapia celular CAR-T tem se mostrado uma grande promessa em neoplasias hematológicas, evidente a partir dos 6 produtos CAR-T aprovados pela FDA desde 2017, conforme relatado pelo Instituto Nacional do Câncer1. Existem numerosas células CAR-T em ensaios clínicos para atingir tumores sólidos. A engenharia de novos alvos CAR e a otimização da construção do CAR são vitais para a eficácia de uma célula CAR-T. A escolha da construção CAR ideal para cada aplicação é essencial para o direcionamento preciso de antígenos associados ao tumor (TAA), evitando baixos níveis de expressão de TAA em tecidos normais2.
Uma construção CAR é feita principalmente de cinco compartimentos: (1) domínio de fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) visando antígeno tumoral; (2) domínio da dobradiça; (3) domínio transmembrana; (4) domínio costimulatório de células T citoplasmáticas intracelulares; e (5) domínio da sinalização. A modificação de cada um desses domínios afeta a precisão do envolvimento da célula CAR-T com sua célula-alvo3. Assim, avaliar a citotoxicidade e a reatividade cruzada desses construtos CAR in vitro é fundamental para escolher o construto certo para progredir em direção a experimentos in vivo. Os métodos atuais de avaliação da citólise por células T incluem ensaio de liberação de 51Cr, ensaio de liberação de lactato desidrogenase, ensaio de imagem bioluminescente, análise celular baseada em impedância em tempo real e ensaio de citometria de fluxo baseado em células 4,5. A plataforma baseada em imagem fluorescente descrita aqui identifica o número de células vivas versus mortas, que é uma quantificação direta da citólise de células T em oposição a um método indireto de avaliação da citólise por células T.
Aqui está uma técnica fácil, econômica, rápida e de alto rendimento com intervenção mínima para avaliar a citotoxicidade de células Jurkat expressando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) CAR contra células de câncer de mama triplo-negativo (TNBC) MDA-MB-231 e células EGFR CRISPR nocautear células MDA-MB-231. As células Jurkat são células de linfócitos T humanos imortalizadas6 que têm sido amplamente utilizadas para estudar os mecanismos de ativação e sinalização das células T7. Além disso, células Jurkat têm sido utilizadas para testes in vitro de CAR em múltiplos estudos 8,9,10,11. As células de Jurkat são facilmente transduzidas por lentivírus e têm proliferação sustentada, e este sistema foi aproveitado para otimizar o domínio da dobradiça de várias construções EGFR CAR.
Este ensaio pode ser usado para rastrear múltiplas construções CAR visando vários antígenos tumorais e usado contra múltiplas linhagens de células tumorais aderentes e em várias relações efetor para tumor (E:T). Além disso, vários pontos de tempo podem ser avaliados, e o número de réplicas pode ser modificado para identificar a melhor matança entre as várias construções do CAR. Os melhores construtos precisam ser confirmados usando células T CD3 derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). O objetivo geral por trás do desenvolvimento deste método é otimizar rapidamente a geometria da dobradiça CAR de uma maneira de alto rendimento, superando barreiras como baixa eficiência de transdução, seguida de confirmação em células T derivadas do PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós propusemos um método rápido para avaliar eficientemente a atividade citolítica alvo-específica induzida pela expressão de CAR em células Jurkat. Todas as construções CAR têm o mesmo scFv, mas diferentes domínios de dobradiça e transmembrana que demonstraram afetar a potência das células CAR-T13. Uma avaliação mais aprofundada da morte inespecífica por esses CAR-J foi feita cultivando-os com células de nocaute de antígeno (KO). Isso demonstra que a morte é antígeno tum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MDA-MB-231 foram um presente gentil do Dr. Shane Stecklein. Os autores agradecem o financiamento do Centro de Câncer da Universidade do Kansas para realizar esta pesquisa.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
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