تقييم سريع للسمية الخلوية في المختبر لمستقبلات المستضد الخيمري المعبرة عن Jurkat باستخدام التصوير الفلوري
Summary
بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.
Abstract
الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هي في طليعة علم الأورام. يتم إنشاء CAR من مجال استهداف (عادة ما يكون جزءا متغيرا أحادي السلسلة ، scFv) ، مع رابط مصاحب داخل السلسلة ، متبوعا بمفصلة ، وغشاء ، ومجال تكلفة. يمكن أن يكون لتعديل مجال الربط داخل السلسلة والمفصلة تأثير كبير على القتل بوساطة CAR. بالنظر إلى العديد من الخيارات المختلفة لكل جزء من بناء CAR ، هناك أعداد كبيرة من التباديل. يعد صنع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، كما أن صنع واختبار العديد من التركيبات يعد استثمارا ثقيلا وماديا. يصف هذا البروتوكول منصة للتقييم السريع لبنيات CAR المحسنة للمفصلات في خلايا Jurkat (CAR-J). خلايا Jurkat عبارة عن خط خلايا تائية خلد مع امتصاص عالي لفيروس العدس ، مما يسمح بنقل CAR بكفاءة. هنا ، نقدم منصة لتقييم CAR-J بسرعة باستخدام جهاز تصوير الفلورسنت ، متبوعا بتأكيد التحلل الخلوي في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.
Introduction
أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وعدا كبيرا في الأورام الخبيثة الدموية ، وهو ما يتضح من 6 منتجات CAR-T المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء منذ عام 2017 ، كما أفاد المعهد الوطني للسرطان1. هناك العديد من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التجارب السريرية لاستهداف الأورام الصلبة. تعد أهداف CAR الجديدة الهندسية وتحسين بنية CAR أمرا حيويا لفعالية خلية CAR-T. يعد اختيار بنية CAR المثالية لكل تطبيق أمرا ضروريا للاستهداف الدقيق للمستضدات المرتبطة بالورم (TAA) مع تجنب المستويات المنخفضة من تعبير TAA في الأنسجة الطبيعية2.
يتكون بناء CAR بشكل أساسي من خمس مقصورات: (1) مجال الجزء المتغير أحادي السلسلة خارج الخلية (scFv) الذي يستهدف مستضد الورم. (2) مجال المفصلات. (3) المجال عبر الغشاء. (4) المجال المكلف للخلايا التائية السيتوبلازمية داخل الخلايا ؛ و (5) مجال الإشارة. يؤثر تعديل كل مجال من هذه المجالات على دقة الخلية التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تتعامل مع الخلية المستهدفة3. ومن ثم ، فإن تقييم السمية الخلوية والتفاعل المتبادل لهذه التركيبات CAR في المختبر أمر بالغ الأهمية لاختيار البنية الصحيحة للتقدم نحو التجارب في الجسم الحي. تشمل الطرق الحالية لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية مقايسة إطلاق 51Cr ، ومقايسة إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات ، ومقايسة التصوير الحيوي ، وتحليل الخلايا القائم على المعاوقة في الوقت الفعلي ، ومقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا 4,5. تحدد المنصة القائمة على التصوير الفلوري الموصوفة هنا عدد الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة ، وهو تقدير كمي مباشر للتحلل الخلوي للخلايا التائية بدلا من طريقة غير مباشرة لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية.
إليك تقنية سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة وعالية الإنتاجية مع الحد الأدنى من التدخل لتقييم السمية الخلوية لخلايا Jurkat التي تعبر عن مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) CAR ضد خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي MDA-MB-231 (TNBC) و EGFR CRISPR تضرب خلايا MDA-MB-231. خلايا Jurkat هي خلايا الخلايا اللمفاوية التائية البشرية6 التي تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تنشيط الخلايا التائية وآليات الإشارة7. علاوة على ذلك ، تم استخدام خلايا Jurkat لاختبار CAR في المختبر في دراسات متعددة8،9،10،11. يتم تحويل خلايا Jurkat بسهولة بواسطة فيروس lentivirus ولها تكاثر مستدام ، وقد تم الاستفادة من هذا النظام لتحسين المجال المفصلي لمختلف تركيبات EGFR CAR.
يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص تركيبات CAR المتعددة التي تستهدف مستضدات الورم المختلفة واستخدامها ضد خطوط الخلايا السرطانية المتعددة الملتصقة وبنسب مختلفة من المستجيب إلى الورم (E: T). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم نقاط زمنية متعددة ، ويمكن تعديل عدد النسخ المتماثلة لتحديد أفضل قتل بين مختلف هياكل CAR. يجب تأكيد أفضل التركيبات باستخدام خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMCs) المشتقة من خلايا CD3 T. الهدف العام وراء تطوير هذه الطريقة هو التحسين السريع لهندسة مفصلات CAR بطريقة عالية الإنتاجية للتغلب على الحواجز مثل كفاءة النقل المنخفضة ، متبوعة بتأكيد في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد اقترحنا هنا طريقة سريعة لتقييم النشاط الخلوي الخاص بالهدف الناجم عن تعبير CAR في خلايا Jurkat بكفاءة. جميع تركيبات CAR لها نفس scFv ولكن مجالات مفصلية وغشائية مختلفة ثبت أنها تؤثر على فاعلية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضداتالوهمية 13. تم إجراء مزيد من التقييم للقتل غير النو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كانت MDA-MB-231 هدية كريمة من الدكتور شين ستيكلين. يقر المؤلفون بالتمويل من مركز السرطان بجامعة كانساس لإجراء هذا البحث.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
