הערכת ציטוטוקסיות מהירה במבחנה של קולטן אנטיגן כימרי Jurkat באמצעות הדמיה פלואורסצנטית
Summary
פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.
Abstract
תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) נמצאים בחזית האונקולוגיה. CAR בנוי מתחום מיקוד (בדרך כלל מקטע משתנה שרשרת יחיד, scFv), עם מקשר תוך-שרשרת נלווה, ואחריו ציר, טרנסממברנה ותחום קוסטימולטורי. שינוי של המקשר התוך-שרשרת ותחום הציר יכול להשפיע באופן משמעותי על הרג בתיווך רכב. בהתחשב באפשרויות השונות הרבות עבור כל חלק של מבנה CAR, ישנם מספר רב של תמורות. ייצור תאי CAR-T הוא תהליך גוזל זמן ויקר, וייצור ובדיקה של מבנים רבים הוא השקעה כבדה בזמן ובחומר. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה להערכה מהירה של מבני CAR ממוטבים לציר בתאי Jurkat (CAR-J). תאי Jurkat הם קו תאי T אימורטלי עם ספיגה גבוהה של לנטיוירוסים, המאפשרים העברת CAR יעילה. כאן, אנו מציגים פלטפורמה להערכה מהירה של CAR-J באמצעות הדמיה פלואורסצנטית, ואחריה אישור של ציטוליזה בתאי T שמקורם ב-PBMC.
Introduction
טיפול בתאי CAR-T הראה הבטחה גדולה בממאירויות המטולוגיות, כפי שעולה מ-6 מוצרי CAR-T שאושרו על ידי ה-FDA מאז 2017, כפי שדווח על ידי המכון הלאומי לסרטן1. ישנם תאי CAR-T רבים בניסויים קליניים להתמקדות בגידולים מוצקים. תכנון מטרות CAR חדשניות ואופטימיזציה של מבנה CAR חיוניים ליעילות של תא CAR-T. בחירת מבנה CAR האידיאלי עבור כל יישום חיונית למיקוד מדויק של אנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) תוך הימנעות מרמות נמוכות של ביטוי TAA ברקמות נורמליות2.
מבנה CAR מורכב בעיקר מחמישה תאים: (1) תחום משתנה חד-תאי חוץ-תאי (scFv) המכוון לאנטיגן גידולי; (2) תחום ציר; (3) תחום טרנסממברנלי; (4) תחום קוסטימולטורי ציטופלזמי תוך-תאי של תאי T; ו-(5) תחום האיתות. שינוי כל אחד מתחומים אלה משפיע על הדיוק של תא CAR-T העוסק בתא היעד שלו3. לפיכך, הערכת ציטוטוקסיות ותגובתיות צולבת של מבני CAR אלה במבחנה היא קריטית לבחירת המבנה הנכון להתקדמות לקראת ניסויים in vivo. השיטות הנוכחיות להערכת ציטוליזה על ידי תאי T כוללות בדיקת שחרור 51Cr, בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז, בדיקת הדמיה ביולומינסנטית, ניתוח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת ובדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים 4,5. הפלטפורמה מבוססת הדימות הפלואורסצנטי המתוארת כאן מזהה את מספר התאים החיים לעומת המתים, שהוא כימות ישיר של ציטוליזה של תאי T בניגוד לשיטה עקיפה להערכת הציטוליזה על ידי תאי T.
להלן טכניקה קלה, חסכונית, מהירה ובעלת תפוקה גבוהה עם התערבות מינימלית להערכת ציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) CAR כנגד תאי סרטן שד טריפל נגטיב (TNBC) של MDA-MB-231 ותאי EGFR CRISPR מחסלים תאי MDA-MB-231. תאי Jurkat הם תאי לימפוציטים אנושיים מסוג Tאימורטליים 6 הנמצאים בשימוש נרחב לחקר הפעלת תאי T ומנגנוני איתות7. יתר על כן, תאי Jurkat שימשו לבדיקות CAR במבחנה במחקרים מרובים 8,9,10,11. תאי Jurkat מתמרים בקלות על ידי lentivirus ויש להם שגשוג מתמשך, ומערכת זו מונפה כדי לייעל את תחום הצירים של מבני EGFR CAR שונים.
בדיקה זו יכולה לשמש לבדיקת מבני CAR מרובים המכוונים לאנטיגנים סרטניים שונים ולהשתמש בהם כנגד קווי תאים סרטניים נצמדים מרובים וביחסי השפעה לגידול (E:T) שונים. בנוסף, ניתן להעריך נקודות זמן מרובות, ולשנות את מספר העותקים המשוכפלים כדי לזהות את ההרג הטוב ביותר בין מבני CAR השונים. המבנים הטובים ביותר צריכים להיות מאושרים באמצעות תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) נגזר CD3 T תאים. המטרה הכוללת מאחורי פיתוח שיטה זו היא לייעל במהירות את הגיאומטריה של ציר CAR באופן בתפוקה גבוהה תוך התגברות על מחסומים כגון יעילות התמרה נמוכה, ולאחר מכן אישור בתאי T הנגזרים מ-PBMC.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן הצענו שיטה מהירה להערכה יעילה של הפעילות הציטוליטית הספציפית למטרה הנגרמת על ידי ביטוי CAR בתאי Jurkat. לכל מבני CAR יש אותו scFv אך תחומי ציר וטרנסממברנה שונים אשר הוכחו כמשפיעים על עוצמת תאי CAR-T13. הערכה נוספת של הרג לא ספציפי על ידי CAR-J אלה נעשתה על ידי תרבית שלהם עם תאי אנטיגן נוק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מד”א-MB-231 היו מתנה חביבה מד”ר שיין סטקליין. המחברים מודים על מימון ממרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס לביצוע מחקר זה.
Materials
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. . Methods in Cell Biology. 167, 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D., Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- . Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis Available from: https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023)
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
