Неонатальная гетеротопическая модель трансплантации сердца крысы для изучения эндотелиально-мезенхимального перехода
Summary
В этой работе представлена животная модель фиброза, индуцированного эндотелиально-мезенхимальным переходом, наблюдаемого при врожденных пороках сердца, таких как критический аортальный стеноз или синдром гипоплазии левых отделов сердца, что позволяет провести детальную гистологическую оценку тканей, идентифицировать регуляторные сигнальные пути и протестировать варианты лечения.
Abstract
Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением субэндокардиальной ткани, оказывает значительное влияние на развитие левого желудочка (ЛЖ) и не позволяет пациентам с врожденным критическим аортальным стенозом и синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) проводить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию. Хирургическая резекция в настоящее время является единственным доступным терапевтическим вариантом, но ЭФЭ часто рецидивирует, иногда с еще более инфильтративным характером роста в соседний миокард.
Для лучшего понимания механизмов, лежащих в основе ЭФЭ, и изучения терапевтических стратегий, была разработана модель на животных, пригодная для доклинических испытаний. Животная модель учитывает, что ЭФЭ является заболеванием незрелого сердца и связано с нарушениями кровотока, что подтверждается клиническими наблюдениями. Таким образом, гетеротопическая трансплантация сердца неонатальных донорских сердец крыс является основой для данной модели.
Неонатальное сердце крысы трансплантируется в брюшную полость крысы-подростка и соединяется с инфраренальной аортой реципиента и нижней полой веной. В то время как перфузия коронарных артерий сохраняет жизнеспособность донорского сердца, застой потока в ЛЖ индуцирует рост EFE в очень незрелом сердце. Основным механизмом образования ЭФЭ является переход эндотелиальных клеток эндокарда в мезенхимальные клетки (EndMT), что является хорошо описанным механизмом раннего эмбрионального развития клапанов и перегородок, а также ведущей причиной фиброза при сердечной недостаточности. Образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение нескольких дней после трансплантации. Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии забор ткани EFE, которая демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с HLHS.
Эта модель in vivo позволяет изучать механизмы развития ЭФЭ в сердце и тестировать варианты лечения для предотвращения этого патологического тканевого образования, а также дает возможность для более обобщенного исследования фиброза, индуцированного EndMT.
Introduction
Эндокардиальный фиброэластоз (ЭФЭ), определяемый накоплением коллагеновых и эластических волокон в субэндокардиальной ткани, проявляется в виде перламутрового или непрозрачного утолщенного эндокарда; ЭФЭ наиболее активно развивается во внутриутробном периоде и в раннем младенчестве1. В аутопсийном исследовании 70% случаев с синдромом гипоплазии левых отделов сердца (СГЛОС) были связаны с наличием EFE2.
Клетки, экспрессирующие маркеры фибробластов, являются основной клеточной популяцией в EFE, но эти клетки также одновременно экспрессируют эндотелиальные маркеры эндокарда, что является признаком происхождения этих EFE-клеток. Наша группа ранее установила, что основной механизм образования EFE включает фенотипическое изменение эндотелиальных клеток эндокарда в фибробласты через эндотелиально-мезенхимальный переход (EndMT)3. EndMT может быть обнаружен с помощью иммуногистохимического двойного окрашивания для эндотелиальных маркеров, таких как кластер дифференцировки (CD) 31 или эндотелиальный (VE)-кадгерин (CD144) и маркеры фибробластов (например, альфа-гладкомышечный актин, α-SMA). Кроме того, ранее мы также установили регуляторную роль пути TGF-ß в этом процессе с активацией транскрипционных факторов SLUG, SNAIL и TWIST3.
EndMT — это физиологический процесс, который происходит во время эмбрионального развития сердца и приводит к образованию перегородок и клапанов из эндокардиальных подушек4, но он также вызывает фиброз органов при сердечной недостаточности, фиброзе почек или раке и играет ключевую роль в атеросклерозе сосудов 5,6,7,8. EndMT при фиброзе сердца в основном регулируется через TGF-β путь, о чем мы и другие сообщали 3,9. Были описаны различные стимулы, индуцирующие EndMT: воспаление 10, гипоксия 11, механические изменения 12 и нарушения кровотока, включая изменения внутриполостного кровотока 13, и EndMT также может быть следствием генетического заболевания 14.
Эта животная модель была разработана с использованием ключевых компонентов развития сердечного ЭФЭ, которыми являются незрелость и изменения внутриполостного кровотока, в частности, застой кровотока. Незрелость была восполнена за счет использования сердец новорожденных крыс в качестве доноров, поскольку известно, что неонатальные крысы являются незрелыми в развитии сразу после рождения. Гетеротопическая трансплантация сердца обеспечивала ограничение внутриполостного кровотока15.
С клинической точки зрения эта животная модель позволяет лучше изучить влияние ЭндМТ на растущий левый желудочек (ЛЖ). Задержка роста, налагаемая на сердце плода и новорожденного путем индуцированного EndMT формирования EFE16, не позволяет пациентам с обструкцией выводящих путей левого желудочка (LVOTO), такими как врожденный критический аортальный стеноз и синдром гипоплазии левых отделов сердца (СГЛО), лечить анатомическую бивентрикулярную хирургическую операцию17. Эта животная модель облегчает изучение клеточных механизмов и регуляции формирования тканей с помощью EndMT и позволяет тестировать варианты фармакологического лечения 3,18.
Трансабдоминальная эхокардиография используется для контроля жизнеспособности, сократительной способности и проходимости анастомозов трансплантата. После эвтаназии образование ЭФЭ можно макроскопически наблюдать в течение 3 дней после трансплантации. Ткань EFE демонстрирует те же гистопатологические характеристики, что и ткань EFE человека у пациентов с LVOTO.
Таким образом, эта животная модель, хотя и разработанная для педиатрического использования в спектре HLHS, может быть применена при изучении различных заболеваний на основе молекулярного механизма EndMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта животная модель гетеротопической трансплантации сердца новорожденного донора крысы в брюшную полость реципиента создает возможность изучать фиброз, полученный из EndMT, путем детальной гистологической оценки тканей, определения регуляторных сигнальных путей и тестирования вариа?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Дополнительными предприятиями – Фондом исследований одного желудочка (SVRF) и Фондом расширения одного желудочка (для И.Ф.), а также стипендией Мариетты Блау от OeAD-GmbH из средств, предоставленных Федеральным министерством образования, науки и исследований Австрии BMBWFC (G.G.).
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
References
- Lurie, P. R. Changing concepts of endocardial fibroelastosis. Cardiology in the Young. 20 (2), 115-123 (2010).
- Crucean, A., et al. Re-evaluation of hypoplastic left heart syndrome from a developmental and morphological perspective. Orphanet Journal of Rare Diseases. 12 (1), 138 (2017).
- Xu, X., et al. Endocardial fibroelastosis is caused by aberrant endothelial to mesenchymal transition. Circulation Research. 116 (5), 857-866 (2015).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Illigens, B. M., et al. Vascular endothelial growth factor prevents endothelial-to-mesenchymal transition in hypertrophy. Annals of Thoracic Surgery. 104 (3), 932-939 (2017).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (12), 2282-2287 (2008).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Souilhol, C., Harmsen, M. C., Evans, P. C., Krenning, G. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 565-577 (2018).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Rieder, F., et al. Inflammation-induced endothelial-to-mesenchymal transition: A novel mechanism of intestinal fibrosis. American Journal of Pathology. 179 (5), 2660-2673 (2011).
- Johnson, F. R. Anoxia as a cause of endocardial fibroelastosis in infancy. AMA Archives of Pathology. 54 (3), 237-247 (1952).
- Shimada, S., et al. Distention of the immature left ventricle triggers development of endocardial fibroelastosis: An animal model of endocardial fibroelastosis introducing morphopathological features of evolving fetal hypoplastic left heart syndrome. Biomedical Research. 2015, 462-469 (2015).
- Weixler, V., et al. Flow disturbances and the development of endocardial fibroelastosis. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (2), 637-646 (2020).
- Purevjav, E., et al. Nebulette mutations are associated with dilated cardiomyopathy and endocardial fibroelastosis. Journal of the American College of Cardiology. 56 (18), 1493-1502 (2010).
- Friehs, I., et al. An animal model of endocardial fibroelastosis. Journal of Surgical Research. 182 (1), 94-100 (2013).
- Emani, S. M., et al. Staged left ventricular recruitment after single-ventricle palliation in patients with borderline left heart hypoplasia. Journal of the American College of Cardiology. 60 (19), 1966-1974 (2012).
- Hickey, E. J., et al. Critical left ventricular outflow tract obstruction: The disproportionate impact of biventricular repair in borderline cases. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 134 (6), 1429-1436 (2007).
- Oh, N. A., et al. Abnormal flow conditions promote endocardial fibroelastosis via endothelial-to-mesenchymal transition, which is responsive to losartan treatment. JACC: Basic to Translational Science. 6 (12), 984-999 (2021).
- Blanchard, J. M., Pollak, R. Techniques for perfusion and storage of heterotopic heart transplants in mice. Microsurgery. 6 (3), 169-174 (1985).
- Kokudo, T., et al. Snail is required for TGFbeta-induced endothelial-mesenchymal transition of embryonic stem cell-derived endothelial cells. Journal of Cell Science. 121 (20), 3317-3324 (2008).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Clark, E. S., et al. A mouse model of endocardial fibroelastosis. Cardiovascular Pathology. 24 (6), 388-394 (2015).
- Kovacic, J. C., et al. Endothelial to mesenchymal transition in cardiovascular disease: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (2), 190-209 (2019).
- Derynck, R., Zhang, Y. E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling. Nature. 425 (6958), 577-584 (2003).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on design, execution, and reporting of animal atherosclerosis studies: A scientific statement from the American Heart Association. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).
