内皮から間葉への移行研究のための新生児異所性ラット心臓移植モデル
Summary
この研究は、重症大動脈弁狭窄症や左心低形成症候群などの先天性心疾患に見られる内皮から間葉への移行誘発性線維症の動物モデルを提示し、詳細な組織学的組織評価、調節シグナル伝達経路の同定、および治療オプションのテストを可能にします。
Abstract
心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織の蓄積によって定義され、左心室(LV)の発達に大きな影響を与え、先天性重症大動脈弁狭窄症および低形成性左心症候群(HLHS)の患者を治癒的解剖学的両心室外科的修復から排除します。現在、外科的切除が唯一の治療法であるが、EFEはしばしば再発し、時には隣接する心筋へのさらに浸潤的な増殖パターンを伴う。
EFEの根底にあるメカニズムをよりよく理解し、治療戦略を探求するために、前臨床試験に適した動物モデルが開発されました。動物モデルは、EFEが未熟な心臓の病気であり、臨床観察によって裏付けられているように、流れの乱れに関連していることを考慮に入れています。したがって、新生仔ラットドナー心臓の異所性心臓移植は、このモデルの基礎です。
新生仔ラットの心臓を思春期ラットの腹部に移植し、レシピエントの腎下大動脈と下大静脈に接続します。冠状動脈の灌流はドナーの心臓の生存率を維持しますが、LV内の流れの停滞は非常に未熟な心臓のEFE増殖を誘発します。EFE形成の根底にあるメカニズムは、心内皮細胞から間葉系細胞への移行(EndMT)であり、これは弁と中隔の初期胚発生のよく知られたメカニズムですが、心不全における線維症の主な原因でもあります。EFEの形成は、移植後数日以内に肉眼的に観察できます。経腹心エコー検査は、移植片の生存率、収縮性、および吻合の開存性を監視するために使用されます。安楽死後、EFE組織が採取され、HLHS患者のヒトEFE組織と同じ組織病理学的特徴を示します。
この in vivo モデルにより、心臓におけるEFE発症のメカニズムを研究し、この病理学的組織形成を予防するための治療オプションをテストすることができ、EndMT誘発性線維症のより一般的な検査の機会を提供します。
Introduction
心内膜線維弾性症(EFE)は、心内膜下組織におけるコラーゲンおよび弾性線維の蓄積によって定義され、真珠状または不透明な肥厚した心内膜として現れる。EFEは、胎児期と乳児期初期に最も活発な成長を遂げます1。剖検研究では、左心低形成症候群(HLHS)の症例の70%がEFE2の存在と関連していました。
線維芽細胞のマーカーを発現する細胞はEFEの主要な細胞集団であるが、これらの細胞は同時に心内膜内皮マーカーも発現しており、これはこれらのEFE細胞の起源を示すものである。私たちのグループは、EFE形成の根底にあるメカニズムには、内皮から間葉への移行(EndMT)3を介した心内皮内皮細胞から線維芽細胞への表現型の変化が関与していることを以前に確立しました。EndMTは、分化クラスター(CD)31や血管内皮(VE)-カドヘリン(CD144)などの内皮マーカーと線維芽細胞マーカー(α-平滑筋アクチン、α-SMAなど)の免疫組織化学的二重染色を使用して検出できます。さらに、このプロセスにおけるTGF-β経路の調節的役割は、転写因子であるSLUG、SNAIL、およびTWIST3の活性化によって確立されました。
EndMTは、胎児期の心臓の発達中に発生し、心内膜クッションから中隔と弁の形成につながる生理学的プロセスですが4、心不全、腎線維症、または癌の臓器線維化も引き起こし、血管アテローム性動脈硬化症に重要な役割を果たします5,6,7,8。心線維症における末期MTは、主にTGF-β経路を介して調節されており、私たちらは3,9を報告しています。炎症10、低酸素症11、機械的変化12、および腔内血流の変化13を含む流れの乱れなど、様々な刺激がEndMTを誘発するために説明されており、EndMTもまた遺伝性疾患14の結果である可能性がある。
この動物モデルは、心筋電波発生の重要な要素である、空洞内血流の未熟さと変化、特に流れの停滞を使用して開発されました。新生仔ラットは出生直後から発達的に未熟であることが知られているため、新生仔ラットの心臓をドナーとして用いることで未熟さを補った。異所性心臓移植では、腔内血流制限が提供された15。
臨床的観点から、この動物モデルは、成長する左心室(LV)に対するEndMTの影響をよりよく調査することを可能にします。EndMT誘発性EFE形成16を介して胎児および新生児の心臓に課せられる成長制限は、先天性重症大動脈弁狭窄症や左心低形成症候群(HLHS)などの左心室流出路閉塞(LVOTO)を有する患者を治癒的解剖学的両心室外科的修復から排除する17。この動物モデルは、EndMTによる組織形成の細胞メカニズムと調節の研究を容易にし、薬理学的治療オプションのテストを可能にします3,18。
経腹心エコー検査は、移植片の生存率、収縮性、および吻合の開存性を監視するために使用されます。安楽死後、EFEの形成は移植後3日以内に肉眼的に観察できます。EFE組織は、LVOTO患者のヒトEFE組織と同じ組織病理学的特徴を示します。
したがって、この動物モデルは、HLHSのスペクトルにおける小児用として開発されましたが、EndMTの分子メカニズムに基づいてさまざまな疾患を研究するときに適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
レシピエントの腹部に新生仔ドナーラットの心臓を異所性移植するこの動物モデルは、詳細な組織学的組織評価を通じてEndMT由来の線維症を研究し、調節シグナル伝達経路を特定し、治療オプションをテストする可能性を生み出します。EndMTは心臓の線維化性疾患の根底にあるメカニズムであるため、このモデルは小児心臓外科の分野やそれ以降の分野で大きな価値があります。このモデルで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、オーストリア連邦教育科学研究省BMBWFCから提供された資金から、追加のベンチャーである単心室研究基金(SVRF)および単心室拡張基金(IFへ)とOeAD-GmbHのマリエッタブラウ奨学金によって資金提供されました。
Materials
| Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000 | CWE, Inc. | 12-03100 | small animal ventilator |
| aSMA | Sigma | A2547 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Axio observer Z1 | Carl Zeiss | inverted microscope | |
| Betadine Solution | Avrio Health L.P. | 367618150092 | |
| CD31 | Invitrogen | MA1-80069 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Antibody for Immunohistochemistry |
| DemeLON Nylon black 10-0 | DemeTECH | NL76100065F0P | 10-0 Nylon suture |
| ETFE IV Catheter, 18G x 2 | TERUMO SURFLO | SR-OX1851CA | intubation cannula |
| Micro Clip 8mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6471 | microvascular clamps |
| Nylon black monofilament 11-0 | SURGICAL SPECIALTIES CORP | AA0130 | 11-0 Nylon |
| O.C.T. Compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for frozen tissue specimen |
| p-SMAD2/3 | Invitrogen | PA5-110155 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Rodent, Tilting WorkStand | Hallowell EMC. | 000A3467 | oblique shelf for intubation |
| Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0 | Braintree Scientific | NC9201231 | Silk suture |
| Slug/Snail | Abcam | ab180714 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18" | Ethicon | J493G | 5-0 Vicryl |
| Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18" | Ethicon | J492G | 6-0 Vicryl |
| VE-Cadherin | Abcam | ab231227 | Antibody for Immunohistochemistry |
| Zeiss OPMI 6-SFR | Zeiss | Surgical microscope | |
| Zen, Blue Edition, 3.6 | Zen | inverted microscope software |
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