Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Neonatal em Rato para Estudo da Transição Endotelial-Mesenquimal

Summary

Este trabalho apresenta um modelo animal de fibrose induzida pela transição endotelial-mesenquimal, como visto em defeitos cardíacos congênitos, como estenose aórtica crítica ou síndrome do coração esquerdo hipoplásico, que permite a avaliação histológica detalhada do tecido, a identificação de vias de sinalização regulatórias e o teste de opções de tratamento.

Abstract

A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de tecido subendocárdico, tem grande impacto no desenvolvimento do ventrículo esquerdo (VE) e impede que pacientes com estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE) façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo. A ressecção cirúrgica é atualmente a única opção terapêutica disponível, mas a EFE frequentemente se repete, às vezes com um padrão de crescimento ainda mais infiltrativo no miocárdio adjacente.

Para entender melhor os mecanismos subjacentes da EFE e explorar estratégias terapêuticas, um modelo animal adequado para testes pré-clínicos foi desenvolvido. O modelo animal leva em consideração que a EFE é uma doença do coração imaturo e está associada a distúrbios de fluxo, como sustentado por observações clínicas. Assim, o transplante cardíaco heterotópico de corações de ratos doados neonatais é a base para esse modelo.

Um coração de rato neonatal é transplantado para o abdômen de um rato adolescente e conectado à aorta infrarrenal e à veia cava inferior do receptor. Enquanto a perfusão das artérias coronárias preserva a viabilidade do coração doador, a estagnação do fluxo dentro do VE induz o crescimento da EFE no coração muito imaturo. O mecanismo subjacente da formação do EFE é a transição das células endoteliais endocárdicas para as células mesenquimais (EndMT), que é um mecanismo bem descrito de desenvolvimento embrionário precoce das valvas e septos, mas também a principal causa de fibrose na insuficiência cardíaca. A formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de dias após o transplante. A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, o tecido da EFE é retirado, e apresenta as mesmas características histopatológicas que o tecido da EFE humana de pacientes com SHCE.

Este modelo in vivo permite estudar os mecanismos de desenvolvimento de EFE no coração e testar opções de tratamento para prevenir a formação desse tecido patológico e fornece a oportunidade para um exame mais generalizado da fibrose induzida por EndMT.

Introduction

A fibroelastose endocárdica (EFE), definida pelo acúmulo de fibras colágenas e elásticas no tecido subendocárdico, apresenta-se como um endocárdio espessado perolado ou opaco; A EFE sofre crescimento mais ativo durante o período fetal e início da infância¹. Em um estudo de autópsia, 70% dos casos com síndrome de hipoplasia do coração esquerdo (SHCE) estavam associados à presença de EFE².

As células que expressam marcadores para fibroblastos são a principal população celular na EFE, mas essas células também expressam concomitantemente marcadores endoteliais endocárdicos, o que é uma indicação da origem dessas células EFE. Nosso grupo estabeleceu anteriormente que o mecanismo subjacente da formação da EFE envolve uma mudança fenotípica de células endoteliais endocárdicas para fibroblastos através da transição endotelial-mesenquimal (EndMT)³. A EndMT pode ser detectada usando dupla coloração imunoistoquímica para marcadores endoteliais, como cluster de diferenciação (CD) 31 ou endotelial vascular (VE)-caderina (CD144) e marcadores de fibroblastos (por exemplo, alfa-actina de músculo liso, α-SMA). Além disso, também estabelecemos previamente o papel regulatório da via do TGF-ß nesse processo com ativação dos fatores de transcrição SLUG, SNAIL e TWIST³.

A EndMT é um processo fisiológico que ocorre durante o desenvolvimento cardíaco embrionário e leva à formação de septos e valvas a partir de coxins endocárdicos4, mas também causa fibrose orgânica na insuficiência cardíaca, fibrose renal ou câncer e desempenha um papel fundamental na aterosclerose vascular 5,6,7,8. A EndMT na fibrose cardíaca é regulada principalmente pela via do TGF-β, como relatamos nós e outros ^3,9. Vários estímulos têm sido descritos para induzir EndMT: inflamação¹⁰, hipóxia¹¹, alterações mecânicas 12 e distúrbios de fluxo, incluindo alterações do fluxo sanguíneo intracavitário 13, e EndMT também pode ser consequência de uma doença genética ¹⁴.

Esse modelo animal foi desenvolvido utilizando os principais componentes do desenvolvimento da EFE cardíaca, que são a imaturidade e as alterações do fluxo sanguíneo intracavitário, especificamente a estagnação do fluxo. A imaturidade foi completada com o uso de corações de ratos neonatais como doadores, uma vez que os ratos neonatais são conhecidos por serem imaturos em termos de desenvolvimento imediatamente após o nascimento. O transplante cardíaco heterotópico ofereceu restrição de fluxo intracavitário¹⁵.

Do ponto de vista clínico, esse modelo animal permite investigar melhor o impacto da EndMT no ventrículo esquerdo (VE) em crescimento. A restrição de crescimento imposta ao coração fetal e neonatal pela formação de EFE induzida por EndMT¹⁶ impede que pacientes com obstruções da via de saída do ventrículo esquerdo (ODVE), como estenose aórtica crítica congênita e síndrome do coração esquerdo hipoplásico (SHCE), façam reparo cirúrgico biventricular anatômico curativo¹⁷. Esse modelo animal facilita o estudo dos mecanismos celulares e a regulação da formação tecidual por meio da EndMT e permite testar opções de tratamento farmacológico ^3,18.

A ecocardiografia transabdominal é usada para monitorar a viabilidade do enxerto, a contratilidade e a patência das anastomoses. Após a eutanásia, a formação de EFE pode ser observada macroscopicamente dentro de 3 dias após o transplante. O tecido da EFE apresenta as mesmas características histopatológicas do tecido da EFE humana de pacientes com ODVE.

Assim, este modelo animal, embora desenvolvido para uso pediátrico no espectro da SHCE, pode ser aplicado no estudo de várias doenças com base no mecanismo molecular da EndMT.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Conselho Nacional de Pesquisa. 2011. Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório: Oitava Edição. Os protocolos dos animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Boston Children’s Hospital. Antes da cirurgia, todos os instrumentais cirúrgicos são autoclavados a vapor, e o tampão Krebs-Henseleit modificado, com concentração final de 22 mmol/L de KCl, é preparado c…

Representative Results

Viabilidade e batimento do enxertoNeste trabalho, a viabilidade do enxerto foi avaliada visualmente após a retirada de todas as pinças, sendo permitido um tempo aproximado de reperfusão de 10-15 min com abdome aberto para observação do enxerto. O mesmo sistema de pontuação para verificar objetivamente a viabilidade do enxerto foi utilizado para a avaliação visual ao final da cirurgia e para o ecocardiograma no DPO 1, DPO 7 e DPO 14. 0 = ausência de função do ó…

Discussion

Este modelo animal de transplante heterotópico de um coração de rato doador neonatal no abdome do receptor cria a possibilidade de estudar a fibrose derivada de EndMT por meio de avaliação histológica detalhada do tecido, identificar vias de sinalização regulatórias e testar opções de tratamento. Uma vez que EndMT é o mecanismo subjacente para doenças fibróticas do coração, este modelo tem grande valor no campo da cirurgia cardíaca pediátrica e além. Nesse modelo, muitos fatores podem influenciar negat…

Materials

Advanced Ventilator System For Rodents, SAR-1000	CWE, Inc.	12-03100	small animal ventilator
aSMA	Sigma	A2547	Antibody for Immunohistochemistry
Axio observer Z1	Carl Zeiss		inverted microscope
Betadine Solution	Avrio Health L.P.	367618150092
CD31	Invitrogen	MA1-80069	Antibody for Immunohistochemistry
DAPI	Invitrogen	D1306	Antibody for Immunohistochemistry
DemeLON Nylon black 10-0	DemeTECH	NL76100065F0P	10-0 Nylon suture
ETFE IV Catheter, 18G x 2	TERUMO SURFLO	SR-OX1851CA	intubation cannula
Micro Clip 8mm	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6471	microvascular clamps
Nylon black monofilament 11-0	SURGICAL SPECIALTIES CORP	AA0130	11-0 Nylon
O.C.T. Compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for frozen tissue specimen
p-SMAD2/3	Invitrogen	PA5-110155	Antibody for Immunohistochemistry
Rodent, Tilting WorkStand	Hallowell EMC.	000A3467	oblique shelf for intubation
Silk Sutures, Non-absorbable, 7-0	Braintree Scientific	NC9201231	Silk suture
Slug/Snail	Abcam	ab180714	Antibody for Immunohistochemistry
Undyed Coated Vicryl 5-0 P-3 18"	Ethicon	J493G	5-0 Vicryl
Undyed Coated Vicryl 6-0 P-3 18"	Ethicon	J492G	6-0 Vicryl
VE-Cadherin	Abcam	ab231227	Antibody for Immunohistochemistry
Zeiss OPMI 6-SFR	Zeiss		Surgical microscope
Zen, Blue Edition, 3.6	Zen		inverted microscope software