Summary

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Mevcut protokol, in vivo görüntülerde gözlenen retinal ganglion hücre akson demeti morfolojisini doğrulamak amacıyla in vivo görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafi (vis-OCTF) görüntülerini aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleriyle hizalama adımlarını özetlemektedir.

Abstract

Son yıllarda, biyolojik sistemler ve süreçler hakkında non-invaziv, gerçek zamanlı ve boylamsal bilgi sağlayan in vivo retinal görüntüleme, göz hastalıklarında nöral hasarın objektif bir değerlendirmesini elde etmek için giderek daha fazla uygulanmaktadır. Aynı retinanın ex vivo konfokal görüntülemesi, özellikle hayvan araştırmalarında in vivo bulguları doğrulamak için sıklıkla gereklidir. Bu çalışmada, fare retinasının ex vivo konfokal görüntüsünü in vivo görüntüleriyle hizalamak için bir yöntem gösterdik. Fare retinasının in vivo görüntülerini elde etmek için görünür ışık optik koherens tomografi fibergrafisi (vis-OCTF) adı verilen yeni bir klinik kullanıma hazır görüntüleme teknolojisi uygulandı. Daha sonra in vivo ve OCTF görüntülerini doğrulamak için “altın standart” ile aynı retinanın konfokal görüntülemesini gerçekleştirdik. Bu çalışma sadece moleküler ve hücresel mekanizmaların daha fazla araştırılmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda in vivo nöral hasarın hassas ve objektif bir değerlendirmesi için bir temel oluşturur.

Introduction

Retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) görsel bilgi işlemede kritik bir rol oynar, iç pleksiform tabakadaki (IPL) dendritik ağaçları aracılığıyla sinaptik girdiler alır ve bilgiyi retina sinir lifi tabakasındaki (RNFL) aksonları aracılığıyla beyne iletir 1,2,3,4. Glokom gibi hastalıklı durumlarda, erken RGC dejenerasyonu, hem hastalarda hem de kemirgen modellerindeRNFL, ganglion hücre tabakası (GCL), IPL ve optik sinirde ince değişikliklere neden olabilir 5,6,7,8,9. Bu nedenle, RGC’lerdeki bu morfolojik değişikliklerin erken tespiti, RGC ve görme kaybını önlemek için zamanında müdahale için gereklidir.

Yakın zamanda, RGC hasarının in vivo izlenmesi ihtiyacını karşılamak için görünür ışık optik koherens tomografi (vis-OCT) adı verilen yeni bir klinik kullanıma hazır görüntüleme teknolojisi geliştirdik. Vis-OCT, retinada 1.3 μm’ye ulaşarak eksenel çözünürlüğü iyileştirdi10,11 ve RNFL’deki bireysel RGC akson demetlerinin görüntülenmesine izin verdi. Daha sonra, farelerde tek akson demeti seviyesinde RGC hasarını izlemek ve ölçmek için vis-OCT fibergrafisi (vs-OCTF) kuruldu11,12,13. Bununla birlikte, in vivo bulguları doğrulamak için altın standart ile aynı retinanın ex vivo konfokal görüntülemesi genellikle gereklidir. Bu nedenle, bu çalışma, OCTF’ye karşı elde edilen in vivo görüntülerin, aynı fare retinasının ex vivo konfokal görüntüleri ile nasıl hizalanacağını gösterecektir. Protokol, ex vivo konfokal görüntüleme ile in vivo bulguları doğrulamayı ve hastalıklı durumlarda RGC hasarının altında yatan moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için bir temel oluşturmayı amaçlamaktadır.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Virginia Üniversitesi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü’nün (NIH) Hayvanların Kullanımı kılavuzuna uygun hale getirildi. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. 1. İn vivo vis-OCT görüntüleme Vis-OCT sistemi480 nm ile 650 nm arasında görünür …

Representative Results

Kompozit vis-OCT fibergramı, RGC aksonları için Tuj-1 ile immün boyanmış düz monte retinanın karşılık gelen konfokal görüntüsü ile karşılaştırılır (Şekil 1D, üst panel). Vis-OCTF ile görüntülenen akson demetleri, konfokal görüntüde Tu-j1 etiketli akson demetleri ile eşleştirilebilir. Kan damarları genellikle, konfokal görüntüdeki ICAM-2 etiketli kan damarları ile eşleştirilebilen fibergram görüntülerinde çevredeki akson demetlerine kıyasla ayırt ed…

Discussion

Bu protokolde dikkat edilmesi gereken iki adım vardır. İlk olarak, hayvanın derin anestezi altında olduğundan ve OCT görüntülemeden önce gözlerinin tamamen genişlediğinden emin olmak gerekir. Fareler yeterince uyuşturulmazsa, hızlı nefes almaları, fibergramın kalitesini olumsuz yönde etkileyebilecek en yüz görüntülerinin dengesiz hareketlerine yol açabilir. Ayrıca, yetersiz genişleme de görüntü kalitesi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir, çünkü iris ışığı engelleyere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Glokom Araştırma Vakfı Shaffer Grant, 4-CA Cavalier İşbirliği Ödülü, R01EY029121, R01EY035088 ve Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)
VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Play Video

Cite This Article
Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

View Video