Summary

محاذاة الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي مع الصور متحدة البؤر لشبكية العين للماوس نفسه

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

يحدد هذا البروتوكول خطوات محاذاة صور التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي في الجسم الحي (vis-OCTF) مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين نفسها لغرض التحقق من مورفولوجيا الحزمة المحورية لخلية العقدة العقدية المرصودة في الصور في الجسم الحي .

Abstract

في السنوات الأخيرة ، تم تطبيق تصوير الشبكية في الجسم الحي ، والذي يوفر معلومات غير جراحية وفي الوقت الفعلي وطولية حول الأنظمة والعمليات البيولوجية ، بشكل متزايد للحصول على تقييم موضوعي للتلف العصبي في أمراض العيون. غالبا ما يكون التصوير البؤري خارج الجسم الحي لنفس شبكية العين ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي خاصة في الأبحاث على. في هذه الدراسة ، أظهرنا طريقة لمحاذاة صورة متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مع صورها في الجسم الحي . تم تطبيق تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCTF) للحصول على صور في الجسم الحي لشبكية الفأر. ثم أجرينا التصوير متحد البؤر لشبكية العين نفسها مثل “المعيار الذهبي” للتحقق من صحة الصور في الجسم الحي مقابل OCTF. لا تتيح هذه الدراسة مزيدا من التحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية فحسب ، بل تضع أيضا أساسا لتقييم حساس وموضوعي للتلف العصبي في الجسم الحي.

Introduction

تلعب خلايا العقدة الشبكية (RGCs) دورا مهما في معالجة المعلومات المرئية ، حيث تتلقى مدخلات متشابكة من خلال أشجارها المتغصنة في الطبقة الضفيرية الداخلية (IPL) وتنقل المعلومات عبر محاورها في طبقة الألياف العصبية الشبكية (RNFL) إلى الدماغ1،2،3،4. في الحالات المريضة مثل الجلوكوما ، قد يؤدي تنكس RGC المبكر إلى تغييرات طفيفة في RNFL ، وطبقة الخلايا العقدية (GCL) ، و IPL ، والعصب البصري في كل من المرضى ونماذج القوارض5،6،7،8،9. وبالتالي فإن الكشف المبكر عن هذه التغيرات المورفولوجية في RGCs أمر ضروري للتدخل في الوقت المناسب لمنع RGC وفقدان البصر.

لقد طورنا مؤخرا تقنية تصوير جديدة جاهزة سريريا تسمى التصوير المقطعي للتماسك البصري للضوء المرئي (vis-OCT) لتلبية الحاجة إلى المراقبة في الجسم الحي لتلف RGC. قام Vis-OCT بتحسين الدقة المحورية ، حيث وصل إلى 1.3 ميكرومتر في شبكية العين10,11 ، مما يسمح بتصور حزم محور RGC الفردية في RNFL. بعد ذلك ، تم إنشاء الألياف vis-OCT (vis-OCTF) لتتبع وقياس تلف RGC على مستوى حزمة محور عصبي واحد في الفئران11،12،13. ومع ذلك ، غالبا ما يكون التصوير متحد البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين مثل المعيار الذهبي ضروريا للتحقق من صحة النتائج في الجسم الحي. لذلك ، ستوضح هذه الدراسة كيفية محاذاة الصور في الجسم الحي التي تم الحصول عليها بواسطة vis-OCTF مع الصور متحدة البؤر خارج الجسم الحي لشبكية العين لنفس الفأر. يهدف البروتوكول إلى التحقق من صحة النتائج في الجسم الحي عن طريق التصوير خارج الجسم الحي متحد البؤر وإنشاء أساس لفحص التغيرات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء تلف RGC في الحالات المرضية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة فيرجينيا وتتوافق مع المبدأ التوجيهي بشأن استخدام من المعهد الوطني للصحة (NIH). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. <p class=…

Representative Results

تمت مقارنة المركب مقابل الألياف OCT مع الصورة البؤرية المقابلة لشبكية العين المثبتة بشكل مسطح والمناعية مع Tuj-1 لمحاور RGC (الشكل 1D ، اللوحة العلوية). يمكن مطابقة الحزم المحورية المصورة بواسطة vis-OCTF مع الحزم المحورية التي تحمل علامة Tu-j1 على الصورة متحدة البؤر. عادة ما تظهر الأوع…

Discussion

هناك خطوتان في هذا البروتوكول تتطلبان الاهتمام. أولا ، من الضروري التأكد من أن يخضع للتخدير العميق وأن عيونه متوسعة بالكامل قبل التصوير المقطعي المحوسب. إذا لم يتم تخدير الفئران بشكل كاف ، فقد يؤدي تنفسها السريع إلى حركات غير مستقرة لصور الوجه ، مما قد يؤثر سلبا على جودة الألياف. علاو?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل مؤسسة أبحاث الجلوكوما شافير جرانت ، وجائزة 4-CA Cavalier التعاونية ، R01EY029121 ، R01EY035088 ، ومؤسسة Knights Templar Eye.

Materials

Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)
VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Play Video

Cite This Article
Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

View Video