Summary

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Il presente protocollo delinea i passaggi per l’allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .

Abstract

Negli ultimi anni, l’imaging retinico in vivo, che fornisce informazioni non invasive, in tempo reale e longitudinali sui sistemi e sui processi biologici, è stato sempre più applicato per ottenere una valutazione obiettiva del danno neurale nelle malattie oculari. L’imaging confocale ex vivo della stessa retina è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo , soprattutto nella ricerca sugli animali. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per allineare un’immagine confocale ex vivo della retina del topo con le sue immagini in vivo . Una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata fibragrafia per tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) è stata applicata per acquisire immagini in vivo della retina del topo. Abbiamo quindi eseguito l’imaging confocale della stessa retina come “gold standard” per convalidare le immagini in vivo vis-OCTF. Questo studio non solo consente ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari, ma stabilisce anche le basi per una valutazione sensibile e obiettiva del danno neurale in vivo.

Introduction

Le cellule gangliari retiniche (RGC) svolgono un ruolo fondamentale nell’elaborazione delle informazioni visive, ricevendo input sinaptici attraverso i loro alberi dendritici nello strato plessiforme interno (IPL) e trasmettendo le informazioni tramite i loro assoni nello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) al cervello 1,2,3,4. In condizioni patologiche come il glaucoma, la degenerazione precoce di RGC può provocare sottili cambiamenti nell’RNFL, nello strato di cellule gangliari (GCL), nell’IPL e nel nervo ottico sia nei pazienti che nei modellidi roditori 5,6,7,8,9. La diagnosi precoce di questi cambiamenti morfologici nelle RGC è quindi essenziale per un intervento tempestivo per prevenire le RGC e la perdita della vista.

Recentemente abbiamo sviluppato una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCT) per soddisfare la necessità di monitoraggio in vivo del danno RGC. Vis-OCT ha migliorato la risoluzione assiale, raggiungendo 1,3 μm nella retina10,11, consentendo la visualizzazione dei singoli fasci assoniali RGC nell’RNFL. Successivamente, è stata istituita la fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) per tracciare e quantificare il danno RGC a livello di singolo fascio assonale nei topi11,12,13. Tuttavia, l’imaging confocale ex vivo della stessa retina del gold standard è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo. Pertanto, questo studio dimostrerà come allineare le immagini in vivo acquisite da vis-OCTF con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina. Il protocollo mira a convalidare i risultati in vivo mediante imaging confocale ex vivo e stabilire una base per esaminare i cambiamenti molecolari e cellulari alla base del danno RGC in condizioni patologiche.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee dell’Università della Virginia e conformi alle linee guida sull’uso degli animali del National Institute of Health (NIH). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. 1. Imaging vis-OCT in vivo Il sistema vis-OCTImmagina gli occhi dei topi …

Representative Results

Il fibrogramma composito vis-OCT viene confrontato con la corrispondente immagine confocale della retina piatta immunocolorata con Tuj-1 per gli assoni RGC (Figura 1D, pannello in alto). I fasci di assoni ripresi da vis-OCTF possono essere abbinati ai fasci di assoni marcati con Tu-j1 sull’immagine confocale. I vasi sanguigni di solito mostrano strutture ramificate distinguibili rispetto ai fasci assoniali circostanti nelle immagini a fibragramma, che possono essere abbinate ai vasi sanguign…

Discussion

Ci sono due passaggi in questo protocollo che richiedono attenzione. Innanzitutto, è necessario assicurarsi che l’animale sia in anestesia profonda e che i suoi occhi siano completamente dilatati prima dell’imaging vis-OCT. Se i topi non sono adeguatamente anestetizzati la loro respirazione veloce può portare a movimenti instabili delle immagini en face , che possono influire negativamente sulla qualità del fibrogramma. Inoltre, una dilatazione insufficiente può anche avere un impatto negativo sulla qualità…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo studio è supportato dalla Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, dal 4-CA Cavalier Collaborative Award, dalla R01EY029121, dalla R01EY035088 e dalla Knights Templar Eye Foundation.

Materials

Equipment
Halo 100 Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 microscope Carl Zeiss
Drugs and antibodies
4% paraformaldehyde (PFA) Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 1-2 drops
Bovine serum albumin powder Fisher Scientific, BP9706-100 1:10
Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 1:1,000
Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 1:1,000
Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) Covetrus, NDC 11695-4860-1 15.6 mg/mL
Ketamine Covetrus, NADA043304 114 mg/kg
Mouse anti-Tuj1 A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia 1:200
Normal donkey serum(NDS) Millipore Sigma, S30-100 mL 1:100
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4
(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 1:10
Rat anti-ICAM-2 BD Pharmingen, Cat#553325 1:500
Tropicamide drops  Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100
(Reagent Grade)
VWR, CAS: 9002-93-1 1:20
Vectashield mounting medium Vector Laboratories Inc. H2000-10
Xylazine Covetrus, NDC59399-110-20 17 mg/kg

References

  1. Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
  2. Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
  3. Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
  4. Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
  5. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
  6. Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
  7. Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
  8. Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
  9. Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
  10. Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
  11. Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
  12. Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
  13. Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
  14. Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
  15. Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
  16. Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
  17. Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
  18. Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
  19. Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
  20. Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
  21. Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).

Play Video

Cite This Article
Chang, S., Xu, W., Fan, W., McDaniel, J. A., Grannonico, M., Miller, D. A., Liu, M., Zhang, H. F., Liu, X. Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina. J. Vis. Exp. (196), e65237, doi:10.3791/65237 (2023).

View Video