Summary

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

Published: May 26, 2023
doi:

Summary

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

Abstract

종양 오가노이드는 원래 원발성 종양 조직의 생물학적 주요 특징을 요약한 3차원(3D) 생체 외 종양 모델입니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 중개 암 연구에 사용되어 왔으며 치료 민감도 및 내성, 세포 간 상호 작용 및 종양 미세환경과의 종양 세포 상호 작용을 평가하는 데 적용할 수 있습니다. 종양 오가노이드는 고급 세포 배양 기술과 특정 성장 인자 칵테일을 갖춘 배양 배지 및 세포 외 환경을 모방하는 생물학적 기저막이 필요한 복잡한 배양 시스템입니다. 원발성 종양 배양을 확립하는 능력은 기원 조직, 세포성 및 종양 등급과 같은 종양의 임상적 특징에 크게 좌우됩니다. 또한 조직 샘플 수집, 재료 품질 및 수량, 올바른 바이오뱅킹 및 보관은 이 절차의 중요한 요소입니다. 실험실의 기술적 역량도 고려해야 할 중요한 요소입니다. 여기에서는 췌장 선암 기원의 신선한 조직 샘플에서 새로운 1차 절제 환자 기증자 조직 또는 환자 유래 이종이식(PDX)에서 생체 외 종양 오가노이드를 배양하는 데 기술적으로나 경제적으로 실현 가능한 검증된 SOP/프로토콜을 보고합니다. 본원에 기술된 기술은 기본적인 조직 배양 및 마우스 시설을 갖춘 실험실에서 수행될 수 있으며, 중개 종양학 분야의 광범위한 응용을 위해 맞춤화되어 있다.

Introduction

종양 오가노이드는 신선한 종양 조직에서 유래하고 암 모델을 제공하는 체외 3차원(3D) 조직 배양물입니다. 종양 오가노이드는 원래 원발성 종양 1,2,3,4의 생물학적 주요 특징을 요약하고 기존의 불멸화된 세포주와 유사하게 최대 몇 개월 동안 증식하고 동결 보존할 수 있습니다. 종양 오가노이드는중개/개인 맞춤형 의학을 위한 환자 유래 종양 모델의 바이오뱅크를 제공하며5 암세포 생물학 시스템/모델의 중요한 발전을 나타냅니다. 환자 유래 종양 오가노이드는 (신)보조 종양학적/약리학적 요법의 효능을 예측하기 위한 생체 외 모델로 사용할 수 있으며, 이를 위해 신선한 종양 조직에서 배양이 확립되고 약물에 대한 민감성 분석 또는 약물형 분석이 환자별로 수행되어 후속 치료 라인에 효과적인 약제를 식별할 수 있습니다 1,4. 또한 종양 오가노이드는 원발성 종양 조직의 가용성 한계를 극복하고, 더 중요한 것은 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 마우스 모델에 대한 우수한 대안 또는 보완 시스템을 제공한다는 것입니다2. 원발성 종양 세포가 원발성 종양의 기능과 복잡한 세포성을 모방하는 암 관련 섬유아세포(CAF), 내피세포, 면역세포와 같은 종양미세환경(TME)에서 발견되는 기질 세포와 결합하면 종양 오가노이드의 복잡성이 증가합니다. 종양 오가노이드는 표준화된 프로토콜 6,7,8,9,10을 사용하여 많은 종양 유형에 대해 확립되었습니다. 대장암 및 유방암 조직을 포함한 다양한 고형 종양으로부터의 오가노이드 증식은 잘 확립되어 있으며 기술적으로 저렴합니다 11,12,13,14,15.

외과적 종양 절제 또는 종양 생검은 원발성 종양 조직 표본을 제공합니다. 이상적으로 종양 조직 표본은 종양 덩어리의 중심 또는 종양의 침범 가장자리뿐만 아니라 종양에 인접한 정상으로 보이는 조직에서 가져와야 합니다. 기존의 2D 배양과 비교했을 때, 종양 오가노이드는 세포외 TME를 모방하는 생물학적 기저막(Matrigel, 하이드로겔 또는 콜라겐 기반 스캐폴드)과 특정 영양소 및 성장 인자를 공급하고 배양에서 세포 증식과 생존력을 지원하는 액체 성장 배지를 포함한 몇 가지 “애드온”이 필요합니다16.

일차 세포 배양의 가장 기본적인 단계는 오염을 방지하기 위해 식염수로 조직을 세척하고, 종양을 기계적으로 1-3mm3의 작은 조각으로 절단/소화하고, 조직의 효소 분해를 위해 콜라겐분해효소로 처리하는 것입니다. 그런 다음 분해된 혼합물을 여과하여 큰 조직 조각을 제거하고, Matrigel과 같은 생물학적 기저막에 재현탁하고, 비부착 성장을 향상시키기 위해 저부착 배양 플레이트에서 돔으로 도금합니다. 기저막 매트릭스 돔은 액체 배양 배지로 덮여 있고 오염을 방지하기 위해 글루타민과 항생제로 보충되며 조직 유형에 따라 특정 성장 인자 7,8,9,16,17이 보충됩니다. 벌크 종양 및 TME 내에 존재하는 다른 관련 세포, 예를 들어 암 관련 섬유아세포(CAF) 및 면역 세포도 분리할 수 있습니다. 최근 검토된이 기술은 18 보다 “현실적인” 종양 환경에서 치료에 대한 반응을 연구하기 위해 다양한 세포 유형을 가진 공동 배양을 확립할 수 있습니다. 또한 세포 간 상호 작용 및 종양 세포와 주변 생물학적 매트릭스 구성 요소 간의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

생검 또는 절제된 위장관 종양 조직을 통해 신선한 조직을 이용한 종양 오가노이드 확립의 보고된 성공률은 약 50%11이며, 후자의 성공률은 조직 유형및 기원4, 특히 종양 등급과 전반적인 종양 세포성에 따라 크게 달라진다. 3차원 종양 모델은 단순한 단세포 응집체에서 다양한 세포 유형으로 구성된 매우 복잡한 엔지니어링 모델에 이르기까지 다양한 복잡성을 가지고 있습니다. 문헌에서 3D 배양을 설명하는 데 사용되는 용어는 스페로이드, 종양구 및 오가노이드와 같은 다른 용어가 사용되기 때문에 매우 일관성이 없습니다 19,20,21 정의에 대한 명확한 합의가 아직 이루어지지 않았기 때문에 이 논문에서는 종양 오가노이드를 생물학적 기저막에 내장된 조직화된 종양 세포 배양으로 설명합니다.

본 연구에서는 신선한 1차 절제 또는 PDX 유래 췌관 선암(PDAC)에서 유래한 신선한 조직 샘플로부터 종양 오가노이드를 확립하기 위해 검증된 프로토콜이 보고되며, 이 프로토콜은 기본적인 조직 배양 시설을 갖춘 대부분의 실험실에서 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 David Tuveson9, Hans Clevers8 및 Aurel Perren7 그룹의 소화 종양 조직에서 종양 오가노이드 또는 튜머로이드를 확립하는 데 현재 사용되는 여러 최첨단 보고 프로토콜에서 채택되었습니다.

이 프로토콜은 신선한 조직을 수확하는 방법에 대해 설명하지 않습니다. 고품질의 신선한 인간 종양 조직을 얻기 위해서는 조직을 채취하는 외과의와 오가노이드 배양을 위해 조직 샘플을 추출하는 병리과 간의 효율적인 조정이 중요합니다. 마찬가지로, PDX를 신선한 조직 공급원으로 사용할 때는 조직 샘플을 채취하는 사람과의 효율적인 조정도 중요합니다. 고품질을 유지하기 위해서는 가능한 한 빨리(채취 후 30-60분 이내) 조직 샘플을 얻는 것이 중요합니다.

Protocol

모든 절차는 Universidad Autónoma de Madrid 윤리 위원회(CEI 103-1958-A337) 및 La Comunidad de Madrid(PROEX 294/19)에서 승인한 실험 동물의 복지를 위한 제도적 지침과 동물과 관련된 생물의학 연구를 위한 국제 지침 지침에 명시된 동물 관리 및 사용의 윤리적 행동 지침에 따라 수행되었습니다. 국제의학기구협의회(CIOMS)에서 개발했습니다. 이 프로토콜은 서면 동의서와 함께 생물 의학 연구에 대한 윤리 원칙을 따?…

Representative Results

시간이 지남에 따라, 특히 처음 몇 주 동안 종양 오가노이드 배양이 어떻게 진행되는지 문서화하여 배양이 다운스트림 분석에서 어떻게 작용하는지 추정하는 것이 중요합니다. 그림 2는 15일 동안 신선한 조직에서 최적의 종양 세포 분리 및 종양 오가노이드 확립의 예를 보여줍니다. 때로는 샘플에 많은 양의 세포 파편이 있어 그림 3과 같이 종양 오가?…

Discussion

종양학 임상 1상에서 약물이 승인될 가능성은 5.1%로 모든 질병 유형 중 가장 낮기 때문에 약리학적 암 치료의 주요 발전은 도전적입니다23. 주된 이유는 암이 매우 이질적이기 때문에 환자 코호트가 주어진 치료에 예상대로 균일하게 반응하지 않기 때문에 보다 개인화된 접근 방식이 필요하다는 것을 강조합니다. 2차원(2D) 배양은 수년 동안 중개 암 연구에 사용되어 왔지만 원발?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 Plataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud (PT20/00045), 보조금 계약 No. 857381에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 프로젝트 VISION(위암 조기 진단을 위한 과학적 우수성 및 혁신 역량 강화 전략)의 자금 지원을 받았습니다. 임상 연구자 및 신흥 연구 그룹을 위한 새로운 연구 프로젝트에 대한 교내 요청 IRYCIS(2021/0446), 환자 유래 오가노이드 2.0 프로젝트(CIBERONC) 및 TRANSCAN II 프로젝트 JTC 2017 “췌장 신경내분비 종양(NExT) 환자의 조기 진단 및 후속 조치를 위한 알고리즘 확립”, 허가 번호 1.1.1.5/ERANET/20/03. 이 프로토콜에 사용된 생물학적 샘플은 BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(B.0000678)에서 제공했으며 ISCIII(PT20/00045)의 Biobanks 및 Biomodels Platform에 통합되었습니다. 또한 NExT 및 VISION 프로젝트의 일환으로 이 프로토콜을 개발하는 데 귀중한 지원을 해주신 Yvonne Kohl, Agapi Kataki Vita Robita 및 Thorsten Knoll에게도 감사드립니다.

Materials

6 well Costar Ultra-low Attachment plates Biofil TCP011006
70 μm pore strainer VWR 732-2758
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer Gibco A10492-01
Amphotericin B Gibco 15290018
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) Nuaire NU-4750E
Cell recovery solution Corning  354253
Collagenase IV Gibco 17104019
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES Gibco 31330-038
DNase Roche 10104159001
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-079-CV
Freezing container, Nalgene Merck C1562
gentleMACS Octo Dissociator Milteny Biotec 130-096-427
HEPES Gibco 15630056
Human Placenta Growth Factor (PlGF) enQuireBio QP6485-EC-100UG
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice Janvier, France 
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Invitrogen RP10931
L-Glutamine Corning 354235
Matrigel Basement Membrane Matrix  Corning 356234
Normocin InvivoGen ant-nr-2
Pasteur pipettes Deltalab 200007
Penicillin Streptomycin Solution (100x) Corning 30-002-CI
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 21-040-CV
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) Gibco PHG0026
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Gibco PHG0311
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL 72304
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501
Surgical Blades Nahita FMB018
Trypsin Gibco 25300054

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Díaz-Alejo, J. F., April-Monn, S., Cihova, M., Buocikova, V., Villalón López, J., Urbanova, M., Lechuga, C. G., Tomas, M., Dubovan, P., Sánchez, B. L., Páez, S. C., Sanjuanbenito, A., Lobo, E., Romio de la Heras, E., Guerra, C., de la Pinta, C., Barreto Melian, E., Rodríguez Garrote, M., Carrato, A., Ruiz-Cañas, L., Sainz, Jr., B., Torres, A., Smolkova, B., Earl, J. Establishment of Pancreatic Cancer-Derived Tumor Organoids and Fibroblasts From Fresh Tissue. J. Vis. Exp. (195), e65229, doi:10.3791/65229 (2023).

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