腫瘍オルガノイドは、がん研究と個別化医療へのアプローチに革命をもたらしました。これらは、臨床的に関連性のある腫瘍モデルであり、研究者は診療所で腫瘍の一歩先を行くことができます。このプロトコルは、新鮮な膵臓腫瘍組織サンプルおよび膵臓腺癌起源の患者由来の異種移植片から腫瘍オルガノイドを確立します。
腫瘍オルガノイドは、元の原発腫瘍組織の生物学的重要な特徴を再現する3次元(3D) ex vivo 腫瘍モデルです。患者由来の腫瘍オルガノイドは、トランスレーショナルがん研究で使用されており、治療の感受性と抵抗性、細胞間相互作用、および腫瘍微小環境との腫瘍細胞相互作用の評価に適用できます。腫瘍オルガノイドは複雑な培養系であり、高度な細胞培養技術と、特定の成長因子カクテルを用いた培地、および細胞外環境を模倣した生物学的基底膜が必要です。原発腫瘍培養を確立する能力は、起源組織、細胞性、および腫瘍の悪性度などの腫瘍の臨床的特徴に大きく依存します。さらに、組織サンプルの収集、材料の質と量、および正しいバイオバンクと保管は、この手順の重要な要素です。また、研究所の技術力も重要な要素です。ここでは、膵臓腺癌由来の新鮮な組織サンプルからの ex vivo 腫瘍オルガノイドの培養に技術的および経済的に実行可能な検証済みのSOP/プロトコルを報告します。本明細書に記載の技術は、基本的な組織培養およびマウス設備を有する実験室で実施することができ、トランスレーショナル腫瘍学分野における幅広い応用のために調整される。
腫瘍オルガノイドは、新鮮な腫瘍組織に由来するex vivoの3次元(3D)組織化培養物であり、がんモデルを提供します。腫瘍オルガノイドは、元の原発腫瘍の生物学的重要な特徴を再現しており1,2,3,4、従来の不死化細胞株と同様に、最大数ヶ月間増殖して凍結保存することができます。腫瘍オルガノイドは、トランスレーショナル/個別化医療5のための患者由来腫瘍モデルのバイオバンクを提供し、がん細胞生物学システム/モデルにおける重要な進歩を表しています。患者由来の腫瘍オルガノイドは、新鮮な腫瘍組織から培養を確立し、その後の治療ラインに有効な薬剤を特定するために患者固有のベースで薬物感受性アッセイまたは薬物型決定が実施される(ネオ)アジュバント腫瘍学的/薬理学的治療の有効性を予測するためのex vivoモデルとして使用できます1,4.さらに、腫瘍オルガノイドは、原発腫瘍組織の利用可能性の限界を克服し、さらに重要なことに、患者由来異種移植片(PDX)などのin vivoマウスモデルに対する優れた代替または補完的なシステムを提供します2。原発腫瘍細胞が、がん関連線維芽細胞(CAF)、内皮細胞、免疫細胞など、腫瘍微小環境(TME)に見られる間質細胞と組み合わされ、原発腫瘍の機能と複雑な細胞性を模倣すると、腫瘍オルガノイドの複雑さが増します。腫瘍オルガノイドは、標準化されたプロトコル6、7、8、9、10を使用して、多くの腫瘍タイプに対して確立されています。結腸直腸癌や乳がん組織を含むさまざまな固形腫瘍からのオルガノイド増殖は十分に確立されており、技術的に手頃な価格です11、12、13、14、15。
外科的腫瘍切除または腫瘍生検は、原発腫瘍組織標本を提供する。理想的には、腫瘍組織標本は、腫瘍塊の中心または腫瘍の浸潤縁、および腫瘍に隣接する正常に見える組織から採取する必要があります。従来の2D培養と比較して、腫瘍オルガノイドは、細胞外TMEを模倣する生物学的基底膜(マトリゲル、ハイドロゲル、コラーゲンベースの足場など)や、特定の栄養素と成長因子を供給し、培養における細胞増殖と生存率をサポートする液体増殖培地など、いくつかの「アドオン」を必要とします16。
初代細胞培養の最も基本的なステップは、汚染を防ぐために生理食塩水で組織を洗浄し、腫瘍を機械的に1〜3mm3の小片に切断/消化し、組織の酵素消化のためにコラゲナーゼで処理することです。次に、消化された混合物をろ過して大きな組織断片を除去し、マトリゲルなどの生物学的基底膜に再懸濁し、非接着性増殖を促進するために低接着性培養プレートにドーム状に播種します。基底膜マトリックスドームは液体培養培地で覆われ、グルタミンと抗生物質が添加され、組織タイプに応じて特定の成長因子が添加されます7,8,9,16,17。がん関連線維芽細胞(CAF)や免疫細胞など、バルク腫瘍およびTME内に存在する他の関連細胞も単離され得る。最近見直されたこの技術18は、より「現実的な」腫瘍環境で治療に対する反応を研究するために、異なる細胞タイプとの共培養を確立することを可能にします。さらに、細胞間相互作用や、腫瘍細胞と周囲の生物学的マトリックスの成分との相互作用を研究することができます。
生検または切除された消化管腫瘍組織からの新鮮組織を使用した腫瘍オルガノイド確立の成功率は約50%であり11、後者からの成功率は、組織の種類と起源4、特に腫瘍の悪性度と全体的な腫瘍細胞性に大きく依存します。3次元腫瘍モデルには、単純な単細胞凝集体から、さまざまな細胞タイプで構成される非常に複雑な工学的モデルまで、さまざまな複雑さがあります。文献で3D培養を説明するために使用される用語は、スフェロイド、腫瘍球、オルガノイドなどの異なる用語が使用されているため、非常に一貫性がありません19,20,21が、それらの違いは不明です。定義に関する明確なコンセンサスはまだ得られていないため、この記事では、腫瘍オルガノイドを生物学的基底膜に埋め込まれた組織化された腫瘍細胞培養として説明しています。
本明細書では、新鮮な原発切除またはPDX由来の膵管腺癌(PDAC)に由来する新鮮な組織サンプルからの腫瘍オルガノイドの確立について検証済みのプロトコルが報告されており、このプロトコルは基本的な組織培養施設を備えたほとんどの実験室で実施できます。このプロトコルは、David Tuveson9、Hans Clevers8、および Aurel Perren7 のグループからの消化器系腫瘍組織から腫瘍オルガノイドまたは腫瘍型を確立するために現在使用されているいくつかの最先端の報告されたプロトコルから適応されています。
このプロトコルでは、新鮮な組織がどのように収穫されるかについては説明しません。高品質の新鮮なヒト腫瘍組織を得るためには、組織を採取する外科医と、オルガノイド培養のために組織サンプルを抽出する病理学部門との間の効率的な調整が重要です。同様に、PDXを新鮮な組織源として使用する場合、組織サンプルを採取する人との効率的な調整も重要です。高品質を維持するためには、組織サンプルをできるだけ早く(採取時間から30〜60分以内に)入手することが重要です。
がん第I相臨床試験で薬剤が承認される可能性は5.1%であり、全疾患タイプ23の中で最も低いため、薬物療法の大きな進歩は困難である。主な理由は、がんは非常に不均一であるため、患者コホートは特定の治療に対して期待どおりに均一に反応せず、より個別化されたアプローチが必要であることを浮き彫りにしています。2次元(2D)培養は、トランスレーショナルがん研究で?…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、助成金契約第857381号に基づく欧州連合のHorizon 2020 Research and Innovation Programme(消化器がんの早期診断のための科学的卓越性とイノベーション能力を強化するための戦略)であるPlataforma biobancos y biomodelos – Unidades de las Plataformas ISCIII de apoyo ala I+D+i en Biomedicina y Ciencias de la Salud(PT20/00045)からの資金提供によって支援されました。 臨床研究者および新興研究グループIRYCIS(2021/0446)、患者由来オルガノイド2.0プロジェクト(CIBERONC)、およびTRANSCAN IIプロジェクトJTC 2017の募集「膵神経内分泌腫瘍(NExT)患者の早期診断とフォローアップのためのアルゴリズムの確立」、助成金番号1.1.1.5 / ERANET / 20/03。このプロトコルで使用された生物学的サンプルは、BioBank Hospital Ramón y Cajal-IRYCIS(B.0000678)から提供され、ISCIII(PT20/00045)のバイオバンクおよびバイオモデルプラットフォームに統合されました。また、Yvonne Kohl氏、Agapi Kataki Vita Rovita氏、Thorsten Knoll氏には、NExTおよびVISIONプロジェクトの一環としてこのプロトコルを開発するための貴重なサポートをいただいたことに感謝します。
6 well Costar Ultra-low Attachment plates | Biofil | TCP011006 | |
70 μm pore strainer | VWR | 732-2758 | |
Ammonium Chloride Potassium (ACK) Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290018 | |
Cell culture incubator (21% O2, 5% CO2 and 37 ºC) | Nuaire | NU-4750E | |
Cell recovery solution | Corning | 354253 | |
Collagenase IV | Gibco | 17104019 | |
DMEM/F-12 (1:1)(1X) with L-Glutamine and HEPES | Gibco | 31330-038 | |
DNase | Roche | 10104159001 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-079-CV | |
Freezing container, Nalgene | Merck | C1562 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Milteny Biotec | 130-096-427 | |
HEPES | Gibco | 15630056 | |
Human Placenta Growth Factor (PlGF) | enQuireBio | QP6485-EC-100UG | |
Immunocompromised female 6-week-old NU-Foxn1nu nude mice | Janvier, France | ||
Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) | Invitrogen | RP10931 | |
L-Glutamine | Corning | 354235 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 356234 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
Pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
Penicillin Streptomycin Solution (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Gibco | PHG0026 | |
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0311 | |
ROCK Inhibitor Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL | 72304 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | |
Surgical Blades | Nahita | FMB018 | |
Trypsin | Gibco | 25300054 |