Aquí, describimos un diseño de micro-impulso, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones juveniles y adolescentes a través de una ventana crítica de desarrollo desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá.
La electrofisiología in vivo proporciona una visión sin precedentes de la dinámica del circuito de subsegundo nivel del cerebro intacto y representa un método de particular importancia para estudiar modelos de ratón de trastornos neuropsiquiátricos humanos. Sin embargo, tales métodos a menudo requieren implantes craneales grandes, que no se pueden usar en ratones en puntos de tiempo de desarrollo tempranos. Como tal, prácticamente no se han realizado estudios de fisiología in vivo en ratones bebés o jóvenes que se comportan libremente, a pesar del hecho de que una mejor comprensión del desarrollo neurológico en esta ventana crítica probablemente proporcionaría información única sobre los trastornos del desarrollo dependientes de la edad, como el autismo o la esquizofrenia. Aquí, se describe un diseño de micro-drive, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones a medida que envejecen desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá, una ventana de tiempo que corresponde aproximadamente a las edades humanas de 2 años hasta la edad adulta. El número de electrodos de registro y los sitios de registro final se pueden modificar y ampliar fácilmente, lo que permite un control experimental flexible del monitoreo in vivo de las regiones cerebrales relevantes para el comportamiento o la enfermedad a lo largo del desarrollo.
El cerebro sufre cambios a gran escala durante las ventanas críticas del desarrollo de la infancia y la adolescencia 1,2,3. Muchas enfermedades neurológicas y psiquiátricas, incluyendo el autismo y la esquizofrenia, se manifiestan por primera vez conductual y biológicamente durante este período de desarrollo cerebral juvenil y adolescente 4,5,6. Si bien se sabe mucho sobre los cambios celulares, sinápticos y genéticos que ocurren a través del desarrollo temprano, comparativamente se sabe poco sobre cómo cambian los procesos a nivel de circuito o red a lo largo de esta ventana de tiempo. Es importante destacar que la función cerebral a nivel de circuito, que en última instancia subyace a comportamientos complejos, memoria y cognición, es una propiedad emergente no predecible de la función celular y sináptica 7,8,9,10. Por lo tanto, para comprender completamente la función cerebral a nivel de red, es necesario estudiar directamente la actividad neuronal a nivel de un circuito neuronal intacto. Además, para identificar cómo se altera la actividad cerebral a lo largo de la progresión de los trastornos neuropsiquiátricos, es fundamental examinar la actividad de la red en un modelo de enfermedad válido durante la ventana temporal específica cuando se manifiestan los fenotipos conductuales de la enfermedad y rastrear los cambios observados a medida que persisten en la edad adulta.
Uno de los organismos modelo científicos más comunes y poderosos es el ratón, con un gran número de cepas genéticas únicas que modelan trastornos del neurodesarrollo con inicio dependiente de la edad de los fenotipos conductuales y / o mnemotécnicos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Si bien es difícil correlacionar puntos de tiempo de desarrollo precisos entre los cerebros de humanos y ratones, las comparaciones morfológicas y de comportamiento indican que los ratones p20-p21 representan las edades humanas de 2-3 años, y los ratones p25-p35 representan las edades humanas de 11-14 años, con ratones que probablemente alcancen el equivalente de desarrollo de un adulto humano de 20 años en p603, 22. Por lo tanto, para comprender mejor cómo se desarrolla el cerebro juvenil e identificar cómo las redes neuronales del cerebro se vuelven disfuncionales en enfermedades como el autismo o la esquizofrenia, sería ideal monitorear directamente la actividad cerebral in vivo en ratones de 20 días a 60 días de edad.
Sin embargo, un desafío fundamental en el monitoreo de la actividad cerebral a través del desarrollo temprano en ratones es el pequeño tamaño y la debilidad relativa de los ratones jóvenes. La implantación crónica de electrodos, que es necesaria para estudios longitudinales del desarrollo cerebral, generalmente requiere una carcasa grande y voluminosa para proteger los cables finos de los electrodos y las placas de interfaz23,24, y los implantes deben estar firmemente unidos al cráneo del ratón, que es más delgado y menos rígido en ratones jóvenes debido a la osificación reducida. Por lo tanto, prácticamente todos los estudios de fisiología de roedores in vivo se han realizado en sujetos adultos debido a su tamaño relativo, fuerza y grosor del cráneo. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que exploran la fisiología cerebral de roedores juveniles in vivo se han realizado en ratas juveniles de tipo salvaje, lo que necesariamente limita la capacidad de monitorear experimentalmente la función cerebral juvenil en un modelo de comportamiento libre de un trastorno humano 25,26,27,28,29,30.
Este manuscrito describe el nuevo alojamiento del implante, un procedimiento de implantación quirúrgica y una estrategia de recuperación posterior a la cirugía para estudiar crónicamente la función cerebral in vivo a largo plazo (hasta 4 o más semanas) de ratones jóvenes a través de una ventana de tiempo crítica para el desarrollo (p20 a p60 y más allá). El procedimiento de implantación permite la fijación fiable y permanente de los electrodos a los cráneos de ratones jóvenes. Además, el diseño de micro-drive es ligero, ya que este micro-drive pesa ~ 4-6 g cuando está completamente ensamblado, y debido al contrapeso mínimo requerido para compensar el peso del implante, no afecta el rendimiento conductual de ratones jóvenes durante los paradigmas de comportamiento típicos.
Los experimentos modernos que exploran la función del circuito neuronal in vivo en roedores a menudo utilizan electrofisiología extracelular a través de electrodos implantados permanentemente para monitorear la actividad de neuronas individuales (es decir, unidades individuales) o poblaciones locales (a través de potenciales de campo local, LFP), pero tales métodos rara vez se aplican a ratones jóvenes debido a desafíos técnicos. Este manuscrito describe un método para obtener registros electrofisiológicos in vivo en ratones a través de las ventanas críticas para el desarrollo de p20 a p60 y más allá. Esta metodología implica un proceso de fabricación para la impresión y construcción de un implante de micro-drive, un procedimiento de implantación quirúrgica y una estrategia de recuperación postoperatoria, todos los cuales están diseñados específicamente para su uso en ratones jóvenes. Varias consideraciones influyeron en el desarrollo de este protocolo, incluido el pequeño tamaño y la debilidad relativa de los ratones jóvenes en comparación con sus contrapartes adultas, así como la osificación reducida del cráneo de ratón juvenil al que se necesitaba unir el microimpulso.
Dos métodos principales comúnmente utilizados para realizar electrofisiología in vivo son matrices de electrodos (por ejemplo, tetrodos) y sondas de silicio. Las sondas de silicio son ligeras, pueden proporcionar un gran número de sitios de registro por unidad de peso y se han utilizado previamente en ratas jóvenes25. Sin embargo, las sondas de silicio son relativamente caras por unidad. En contraste, el micro-drive descrito en este manuscrito se puede construir utilizando menos de $ 50 USD en materias primas, lo que lo convierte en una opción rentable para la grabación in vivo . Además, las sondas de silicio a menudo deben implantarse en líneas fijas, lo que prohíbe el registro de regiones cerebrales espacialmente diversas. En contraste, el diseño de micro-drive descrito en este manuscrito utiliza tetrodes ajustables independientemente para acomodar grabaciones simultáneas en hasta 16 ubicaciones diferentes sin prácticamente ninguna restricción en la relación espacial entre esas ubicaciones. Este diseño de microaccionamiento se puede modificar fácilmente para permitir apuntar a ubicaciones diferentes a las descritas aquí moviendo las extrusiones de orificios de cánula a cualquier ubicación anterior / posterior y medial / distal deseada. Cuando se dirige a áreas cerebrales alternativas, es importante tener en cuenta que, si bien los tetrodes a menudo viajan rectos, es posible que estos cables delgados se desvíen ligeramente a medida que salen de la cánula de micro-drive. Por lo tanto, cuanto más pequeña o más ventral sea una región del cerebro, más difícil será apuntar con éxito al área con tetrodos.
El implante de micro-drive descrito en este manuscrito es fundamentalmente similar a varios diseños anteriores de micro-drive basados en tetrode 23,32,33,34,35 en que los tetrodes individuales están fijados a tornillos, que permiten el control fino de la profundidad de grabación de cada tetrode. Si bien varias características del diseño actual de micro-drive son únicas, incluida la facilidad de dirigirse a áreas cerebrales distribuidas espacialmente, la principal novedad del manuscrito actual es la descripción de la implantación quirúrgica y las estrategias de recuperación postoperatoria, que permiten estudios crónicos de la actividad de la red en ratones juveniles aún en desarrollo. De hecho, las metodologías de cirugía y recuperación descritas aquí podrían adaptarse para soportar otros implantes en ratones jóvenes.
Para mantener un registro consistente durante varios días, los cables o sondas deben fijarse rígidamente al cráneo. Mientras que la estructura general del cráneo del ratón sufre sólo cambios menores después de p20, el cráneo se engrosa considerablemente entre las edades de p20 y p4536. De hecho, el cráneo en p20 no es lo suficientemente rígido como para soportar un implante conectado sin dañarse. Para superar esta limitación biológica, este protocolo engrosa artificialmente el cráneo a través de cianoacrilato durante la cirugía de implantación. La implantación en ratones menores de p20 es probablemente posible utilizando esta estrategia, pero el cráneo del ratón sufre cambios considerables de tamaño y forma hasta aproximadamente p2036. Por lo tanto, no se recomienda la implantación durante períodos prolongados en ratones menores de p20, ya que el cianoacrilato y los tornillos óseos fijos en el cráneo aún en desarrollo pueden afectar significativamente el crecimiento natural del cráneo y el desarrollo del tejido cerebral subyacente. Es importante destacar que, en este estudio, no se observó ningún impacto en las mediciones brutas del tamaño del cráneo o del cerebro después de la implantación crónica a partir de p20 (Figura 5C).
Un paso crítico en el método descrito en este manuscrito es la estrategia de recuperación postoperatoria; De acuerdo con esta estrategia, el peso del implante debe contrarrestarse continuamente a medida que el ratón madura y se somete al desarrollo del sistema muscular y musculoesquelético. Poco después de la implantación, los ratones no pueden soportar con éxito el peso del implante sin el contrapeso, lo que lleva a la desnutrición y la deshidratación, ya que el ratón no puede alcanzar adecuadamente las fuentes de alimentos y agua en su jaula. El sistema de contrapeso es fácil y económico de construir, trivial de implementar, y permite a los ratones de cualquier edad implantable explorar libremente la totalidad de su jaula doméstica, asegurando así una nutrición e hidratación adecuadas. A medida que los ratones envejecen, la cantidad de contrapeso puede reducirse hasta que pueda eliminarse por completo en ratones adultos; Sin embargo, se recomienda el uso continuado del sistema de contrapeso durante la duración del experimento con al menos un contrapeso nominal unido en todo momento. Mientras que un ratón adulto puede ser capaz de soportar el tamaño y el peso del micro-drive con el tiempo, el movimiento natural continuo durante el comportamiento libre sin contrapeso de mejora produce torsión y fuerza de cizallamiento en los tornillos óseos que anclan el micro-drive en el cráneo, lo que hace que sea cada vez más probable que se desprenda, especialmente durante experimentos crónicos más largos.
Dos limitaciones importantes son de destacar para el presente estudio. Primero, para evaluar el impacto de la implantación en p20 en el desarrollo del cráneo y el cerebro, varias cohortes de ratones fueron sacrificadas después de una implantación prolongada (Figura 5C). Si bien estos análisis no revelaron un impacto significativo de la implantación en el tamaño de la cavidad craneal o la masa cerebral (Figura 5C), el estudio actual no examinó el tamaño del cráneo o la masa cerebral en múltiples puntos de tiempo durante el período de desarrollo temprano de p20-p60. Si bien el trabajo previo demuestra que el desarrollo de la cavidad cerebral se completa en p2036, es posible que la implantación en esta ventana temprana pueda producir cambios imprevistos que se corrigen o compensan con las edades adultas que se evaluaron aquí. En segundo lugar, los experimentos que produjeron los datos electrofisiológicos que se muestran en la Figura 3 y la Figura 4 no fueron diseñados para maximizar el rendimiento celular. Por lo tanto, si bien los datos presentados aquí demuestran registros estables y crónicos y unidades individuales bien aisladas, no deben tomarse como representativos del rendimiento potencial máximo para este dispositivo.
Muchos trastornos neurológicos y psiquiátricos humanos se manifiestan durante períodos de desarrollo temprano o durante la adolescencia, incluido el autismo y la esquizofrenia. Sin embargo, se sabe poco sobre la disfunción a nivel de circuito que puede subyacer a estas enfermedades, a pesar de la gran cantidad de modelos de ratón disponibles. La identificación de estos cambios iniciales en la red es fundamental para crear estrategias de detección temprana y paradigmas de tratamiento. Sin embargo, debido a los desafíos técnicos, no está claro cómo se interrumpe la función de la red a través del desarrollo en modelos de ratón de enfermedades neuropsiquiátricas. La estrategia de microimpulso y recuperación descrita aquí está diseñada para apoyar las investigaciones sobre el desarrollo de redes cerebrales multirregionales en el cerebro del ratón y, por lo tanto, permitir a los investigadores medir el desarrollo cerebral saludable, así como identificar alteraciones en ese desarrollo en modelos de enfermedad de ratón.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) y F99NS12053 (L.D.Q.) y el Premio de Dotación UT SOUTHWESTERN GSO (R.J.P. y L.D.Q.). Los autores agradecen a Jenny Scaria (Facultad de Farmacia del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas) por su asistencia técnica y al Dr. Brendon Watson (Universidad de Michigan) por sus sugerencias metodológicas.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |