Ici, nous décrivons une conception de micro-entraînement, une procédure d’implantation chirurgicale et une stratégie de récupération post-chirurgicale qui permettent des enregistrements chroniques sur le terrain et à une seule unité de plusieurs régions du cerveau simultanément chez des souris juvéniles et adolescentes à travers une fenêtre de développement critique du jour postnatal 20 (p20) au jour postnatal 60 (p60) et au-delà.
L’électrophysiologie in vivo fournit un aperçu inégalé de la dynamique des circuits de sous-seconde du cerveau intact et représente une méthode d’une importance particulière pour l’étude de modèles murins de troubles neuropsychiatriques humains. Cependant, de telles méthodes nécessitent souvent de grands implants crâniens, qui ne peuvent pas être utilisés chez la souris au début du développement. En tant que tel, pratiquement aucune étude de physiologie in vivo n’a été réalisée sur des souris nourrissons ou juvéniles se comportant librement, malgré le fait qu’une meilleure compréhension du développement neurologique dans cette fenêtre critique fournirait probablement des informations uniques sur les troubles du développement liés à l’âge tels que l’autisme ou la schizophrénie. Ici, une conception de micro-entraînement, une procédure d’implantation chirurgicale et une stratégie de récupération post-chirurgicale sont décrites qui permettent des enregistrements chroniques sur le terrain et à une seule unité de plusieurs régions du cerveau simultanément chez les souris à mesure qu’elles vieillissent du jour postnatal 20 (p20) au jour postnatal 60 (p60) et au-delà, une fenêtre temporelle correspondant à peu près à l’âge humain de 2 ans à l’âge adulte. Le nombre d’électrodes d’enregistrement et de sites d’enregistrement finaux peut être facilement modifié et étendu, permettant ainsi un contrôle expérimental flexible de la surveillance in vivo des régions cérébrales pertinentes pour le comportement ou la maladie tout au long du développement.
Le cerveau subit des changements à grande échelle au cours des fenêtres de développement critiques de l’enfance et de l’adolescence 1,2,3. De nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques, y compris l’autisme et la schizophrénie, se manifestent d’abord comportementalement et biologiquement au cours de cette période de développement du cerveau juvénile et adolescent 4,5,6. Bien que l’on en sache beaucoup sur les changements cellulaires, synaptiques et génétiques qui se produisent au début du développement, on en sait relativement peu sur la façon dont les processus au niveau du circuit ou du réseau changent tout au long de cette fenêtre temporelle. Il est important de noter que la fonction cérébrale au niveau du circuit, qui sous-tend finalement les comportements complexes, la mémoire et la cognition, est une propriété émergente non prévisible de la fonction cellulaire et synaptique 7,8,9,10. Ainsi, pour bien comprendre le fonctionnement cérébral au niveau du réseau, il est nécessaire d’étudier directement l’activité neuronale au niveau d’un circuit neuronal intact. En outre, pour identifier comment l’activité cérébrale est modifiée tout au long de la progression des troubles neuropsychiatriques, il est essentiel d’examiner l’activité du réseau dans un modèle de maladie valide pendant la fenêtre temporelle spécifique lorsque les phénotypes comportementaux de la maladie se manifestent et de suivre les changements observés à mesure qu’ils persistent à l’âge adulte.
L’un des organismes modèles scientifiques les plus courants et les plus puissants est la souris, avec un grand nombre de souches génétiques uniques qui modélisent les troubles neurodéveloppementaux avec l’apparition en fonction de l’âge des phénotypes comportementaux et / ou mnémoniques 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Bien qu’il soit difficile de corréler des points de temps de développement précis entre les cerveaux des humains et des souris, les comparaisons morphologiques et comportementales indiquent que les souris p20-p21 représentent les âges humains de 2-3 ans, et les souris p25-p35 représentent les âges humains de 11-14 ans, les souris atteignant probablement l’équivalent de développement d’un adulte humain de 20 ans par p603, 22. Ainsi, pour mieux comprendre comment le cerveau juvénile se développe et identifier comment les réseaux neuronaux du cerveau deviennent dysfonctionnels dans des maladies comme l’autisme ou la schizophrénie, il serait idéal de surveiller directement l’activité cérébrale in vivo chez des souris âgées de 20 jours à 60 jours.
Cependant, un défi fondamental dans la surveillance de l’activité cérébrale tout au long du développement précoce chez la souris est la petite taille et la faiblesse relative des souris juvéniles. L’implantation chronique d’électrodes, qui est nécessaire pour les études longitudinales du développement du cerveau, nécessite généralement un boîtier volumineux et encombrant pour protéger les fils d’électrodes fins et les cartes d’interface23,24, et les implants doivent être fermement attachés au crâne de souris, qui est plus mince et moins rigide chez les jeunes souris en raison de l’ossification réduite. Ainsi, pratiquement toutes les études sur la physiologie in vivo des rongeurs ont été réalisées chez des sujets adultes en raison de leur taille relative, de leur force et de l’épaisseur du crâne. À ce jour, la plupart des études explorant la physiologie in vivo du cerveau des rongeurs juvéniles ont été réalisées sur des rats juvéniles de type sauvage, ce qui limite nécessairement la capacité de surveiller expérimentalement la fonction cérébrale juvénile dans un modèle de comportement libre d’un trouble humain 25,26,27,28,29,30.
Ce manuscrit décrit un nouveau boîtier implantaire, une procédure d’implantation chirurgicale et une stratégie de récupération post-chirurgicale pour étudier de manière chronique la fonction cérébrale in vivo à long terme (jusqu’à 4 semaines ou plus) de souris juvéniles sur une fenêtre temporelle critique pour le développement (p20 à p60 et au-delà). La procédure d’implantation permet l’apposition fiable et permanente des électrodes sur le crâne de souris juvéniles. De plus, la conception du micro-entraînement est légère, car ce micro-entraînement pèse ~ 4-6 g lorsqu’il est complètement assemblé, et en raison du contrepoids minimal requis pour compenser le poids de l’implant, il n’a pas d’impact sur les performances comportementales des souris juvéniles au cours des paradigmes comportementaux typiques.
Les expériences modernes explorant la fonction in vivo des circuits neuronaux chez les rongeurs utilisent souvent l’électrophysiologie extracellulaire via des électrodes implantées de manière permanente pour surveiller l’activité de neurones individuels (c’est-à-dire des unités uniques) ou de populations locales (via des potentiels de champ locaux, LFP), mais de telles méthodes sont rarement appliquées aux souris juvéniles en raison de défis techniques. Ce manuscrit décrit une méthode pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques in vivo chez la souris à travers les fenêtres critiques pour le développement de p20 à p60 et au-delà. Cette méthodologie implique un processus de fabrication pour l’impression et la construction d’un implant micro-entraînement, une procédure d’implantation chirurgicale et une stratégie de récupération post-chirurgicale, qui sont tous spécifiquement conçus pour une utilisation chez les souris juvéniles. Plusieurs considérations ont influencé l’élaboration de ce protocole, notamment la petite taille et la faiblesse relative des souris juvéniles par rapport à leurs homologues adultes, ainsi que l’ossification réduite du crâne de souris juvénile sur lequel le micro-entraînement devait être fixé.
Les deux principales méthodes couramment utilisées pour effectuer l’électrophysiologie in vivo sont les réseaux d’électrodes (par exemple, les tétrodes) et les sondes de silicium. Les sondes en silicium sont légères, peuvent fournir un grand nombre de sites d’enregistrement par unité de poids et ont déjà été utilisées chez des rats juvéniles25. Cependant, les sondes en silicium sont relativement chères par unité. En revanche, le micro-entraînement décrit dans ce manuscrit peut être construit en utilisant moins de 50 USD en matières premières, ce qui en fait une option rentable pour l’enregistrement in vivo . De plus, les sondes en silicium doivent souvent être implantées dans des lignes fixes, ce qui interdit l’enregistrement de régions cérébrales spatialement diverses. En revanche, la conception de micro-entraînement décrite dans ce manuscrit utilise des tétrodes réglables indépendamment pour accueillir des enregistrements simultanés dans jusqu’à 16 endroits différents sans pratiquement aucune restriction sur la relation spatiale entre ces emplacements. Cette conception de micro-entraînement peut être facilement modifiée pour permettre de cibler des emplacements différents de ceux décrits ici en déplaçant les extrusions de trous de canule vers n’importe quel emplacement antérieur/postérieur et médial/distal souhaité. Lorsque vous ciblez d’autres zones cérébrales, il est important de noter que même si les tétrodes se déplacent souvent tout droit, il est possible que ces fils minces défligent légèrement lorsqu’ils sortent de la canule du micro-entraînement. Ainsi, plus une région du cerveau est petite ou ventrale, plus il sera difficile de cibler avec succès la zone avec des tétrodes.
L’implant de micro-entraînement décrit dans ce manuscrit est fondamentalement similaire à plusieurs conceptions antérieures de micro-entraînements à base de tétrodes 23,32,33,34,35 en ce sens que les tétrodes individuelles sont fixées à des vis, ce qui permet le contrôle fin de la profondeur d’enregistrement de chaque tétrode. Bien que plusieurs caractéristiques de la conception actuelle du micro-entraînement soient uniques, y compris la facilité de cibler les zones cérébrales distribuées spatialement, la principale nouveauté du présent manuscrit est la description de l’implantation chirurgicale et des stratégies de récupération post-chirurgicales, qui permettent des études chroniques de l’activité du réseau chez les souris juvéniles encore en développement. En effet, les méthodologies de chirurgie et de récupération décrites ici pourraient être adaptées pour soutenir d’autres implants chez les souris juvéniles.
Pour maintenir un enregistrement cohérent sur plusieurs jours, les fils ou les sondes doivent être fixés de manière rigide au crâne. Alors que la structure globale du crâne de souris ne subit que des changements mineurs après p20, le crâne s’épaissit considérablement entre les âges p20 et p4536. En effet, le crâne à p20 est insuffisamment rigide pour supporter un implant fixé sans être endommagé. Pour pallier cette limitation biologique, ce protocole épaissit artificiellement le crâne via du cyanoacrylate lors de la chirurgie d’implantation. L’implantation chez des souris plus jeunes que p20 est probablement possible en utilisant cette stratégie, mais le crâne de souris subit des changements de taille et de forme considérables jusqu’à environ p2036. Ainsi, l’implantation pendant de longues périodes chez des souris de moins de p20 n’est pas recommandée car le cyanoacrylate et les vis osseuses fixes dans le crâne encore en développement peuvent avoir un impact significatif sur la croissance naturelle du crâne et le développement du tissu cérébral sous-jacent. Fait important, dans cette étude, aucun impact sur les mesures brutes du crâne ou de la taille du cerveau n’a été observé après une implantation chronique commençant à p20 (Figure 5C).
Une étape critique de la méthode décrite dans ce manuscrit est la stratégie de récupération post-opératoire; Selon cette stratégie, le poids de l’implant doit être continuellement contrebalancé à mesure que la souris mûrit et subit un développement du système musculaire et musculo-squelettique. Tôt après l’implantation, les souris sont incapables de supporter avec succès le poids de l’implant sans contrepoids, ce qui entraîne une malnutrition et une déshydratation car la souris ne peut pas atteindre correctement les sources de nourriture et d’eau dans sa cage. Le système de contrepoids est facile et peu coûteux à construire, trivial à mettre en œuvre et permet aux souris de tout âge implantable d’explorer librement l’intégralité de leur cage domestique, assurant ainsi une nutrition et une hydratation adéquates. À mesure que les souris vieillissent, la quantité de contrepoids peut être réduite jusqu’à ce qu’elle puisse être entièrement éliminée chez les souris adultes; Cependant, l’utilisation continue du système de contrepoids est recommandée pendant toute la durée de l’expérience avec au moins un contrepoids nominal attaché à tout moment. Alors qu’une souris adulte peut être capable de supporter la taille et le poids du micro-drive au fil du temps, le mouvement naturel continu pendant le comportement libre sans contrepoids améliorant produit un couple et une force de cisaillement sur les vis osseuses qui ancrent le micro-drive sur le crâne, ce qui le rend de plus en plus susceptible de se détacher, en particulier lors d’expériences chroniques plus longues.
Deux limites importantes sont à noter pour la présente étude. Tout d’abord, pour évaluer l’impact de l’implantation à p20 sur le développement du crâne et du cerveau, plusieurs cohortes de souris ont été sacrifiées après une implantation prolongée (Figure 5C). Bien que ces analyses n’aient révélé aucun impact significatif de l’implantation sur la taille de la cavité crânienne ou la masse cérébrale (Figure 5C), la présente étude n’a pas examiné la taille du crâne ou la masse cérébrale à plusieurs moments tout au long de la période de développement précoce de p20-p60. Bien que des travaux antérieurs démontrent que le développement de la cavité cérébrale est terminé à p2036, il est possible que l’implantation à cette fenêtre précoce puisse produire des changements imprévus qui sont corrigés ou compensés par les âges adultes qui ont été évalués ici. Deuxièmement, les expériences qui ont produit les données électrophysiologiques présentées à la figure 3 et à la figure 4 n’ont pas été conçues pour maximiser le rendement cellulaire. Ainsi, bien que les données présentées ici démontrent des enregistrements stables et chroniques et des unités individuelles bien isolées, elles ne doivent pas être considérées comme représentatives du rendement potentiel maximal de ce dispositif.
De nombreux troubles neurologiques et psychiatriques humains se manifestent pendant les périodes de développement précoce ou à l’adolescence, y compris l’autisme et la schizophrénie. Cependant, on sait peu de choses sur le dysfonctionnement au niveau du circuit qui peut sous-tendre ces maladies, malgré la pléthore de modèles murins disponibles. L’identification de ces changements initiaux du réseau est essentielle pour créer des stratégies de détection précoce et des paradigmes de traitement. Pourtant, en raison de défis techniques, on ne sait toujours pas comment la fonction du réseau est perturbée tout au long du développement dans des modèles murins de maladies neuropsychiatriques. La stratégie de microentraînement et de rétablissement décrite ici est conçue pour soutenir les recherches sur le développement du réseau cérébral multirégional dans le cerveau de la souris et, ainsi, permettre aux chercheurs de mesurer le développement sain du cerveau ainsi que d’identifier les altérations de ce développement dans les modèles murins de maladie.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) et F99NS12053 (L.D.Q.) et le UT Southwestern GSO Endowment Award (R.J.P. et L.D.Q.). Les auteurs remercient Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy) pour son assistance technique et le Dr Brendon Watson (Université du Michigan) pour ses suggestions méthodologiques.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |