여기에서는 출생 후 20일(p20)부터 출생 후 60일(p60) 및 그 이후까지 중요한 발달 기간에 걸쳐 청소년 및 청소년 마우스의 여러 뇌 영역에서 동시에 여러 뇌 영역의 만성 필드 및 단일 단위 기록을 허용하는 마이크로 드라이브 설계, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략에 대해 설명합니다.
생체 내 전기생리학은 온전한 뇌의 초급 회로 역학에 대한 비할 데 없는 통찰력을 제공하며 인간 신경 정신 장애의 마우스 모델을 연구하는 데 특히 중요한 방법을 나타냅니다. 그러나 이러한 방법은 종종 큰 두개골 임플란트를 필요로 하며, 이는 초기 발달 시점에서 마우스에서 사용할 수 없습니다. 따라서 이 중요한 창에서 신경학적 발달에 대한 더 나은 이해가 자폐증이나 정신분열증과 같은 연령 의존적 발달 장애에 대한 고유한 통찰력을 제공할 가능성이 있음에도 불구하고 자유롭게 행동하는 유아 또는 청소년 마우스에서 생체 내 생리학에 대한 연구는 거의 수행되지 않았습니다. 여기에서는 출생 후 20일(p20)부터 출생 후 60일(p60)까지 나이가 들어감에 따라 생쥐에서 동시에 여러 뇌 영역의 만성 필드 및 단일 단위 기록을 허용하는 마이크로 드라이브 설계, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략에 대해 설명합니다. 기록 전극 및 최종 기록 부위의 수는 쉽게 수정하고 확장할 수 있으므로 발달 전반에 걸쳐 행동 또는 질병 관련 뇌 영역의 생체 내 모니터링을 유연하게 실험적으로 제어할 수 있습니다.
뇌는 아동기와 청소년기의 중요한 발달 기간 동안 대규모 변화를 겪습니다 1,2,3. 자폐증과 정신분열증을 포함한 많은 신경학적 및 정신과적 질환은 이 청소년 및 청소년 뇌 발달 기간 동안 행동적, 생물학적으로 처음 나타납니다 4,5,6. 초기 발달 전반에 걸쳐 발생하는 세포, 시냅스 및 유전적 변화에 대해서는 많이 알려져 있지만, 이 기간 동안 회로 또는 네트워크 수준 프로세스가 어떻게 변하는지에 대해서는 비교적 알려진 바가 거의 없습니다. 중요하게도, 궁극적으로 복잡한 행동, 기억 및 인지의 기초가 되는 회로 수준의 뇌 기능은 세포 및 시냅스 기능의 예측할 수 없고 창발적인 특성입니다 7,8,9,10. 따라서 네트워크 수준의 뇌 기능을 완전히 이해하려면 온전한 신경 회로 수준에서 신경 활동을 직접 연구해야 합니다. 또한, 신경 정신 장애의 진행 전반에 걸쳐 뇌 활동이 어떻게 변경되는지 확인하기 위해서는 질병의 행동 표현형이 나타날 때 특정 시간 창 동안 유효한 질병 모델에서 네트워크 활동을 조사하고 관찰된 변화를 추적하는 것이 중요합니다.
가장 흔하고 강력한 과학적 모델 유기체 중 하나는 행동 및/또는 니모닉 표현형의 연령 의존적 발병을 동반한 신경 발달 장애를 모델링하는 많은 수의 고유한 유전적 균주를 가진 마우스입니다 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . 인간과 생쥐의 뇌 사이의 정확한 발달 시점을 연관시키는 것은 어렵지만, 형태학적 및 행동적 비교에 따르면 p20-p21 마우스는 2-3세의 인간 연령을 나타내고 p25-p35 마우스는 11-14세의 인간 연령을 나타내며 마우스는 p603까지 인간 20세 성인과 동등한 발달 상태에 도달할 가능성이 높습니다. 22. 따라서 청소년 뇌가 어떻게 발달하는지 더 잘 이해하고 자폐증이나 정신 분열증과 같은 질병에서 뇌의 신경망이 어떻게 기능 장애를 일으키는지 확인하려면 생후 20 일에서 60 일 사이의 생쥐에서 생체 내 뇌 활동을 직접 모니터링하는 것이 이상적입니다.
그러나 생쥐의 초기 발달 전반에 걸쳐 뇌 활동을 모니터링하는 근본적인 문제는 어린 생쥐의 작은 크기와 상대적 약점입니다. 뇌 발달의 종단적 연구에 필요한 전극의 만성 이식은 전형적으로 미세 전극 와이어들 및 인터페이스 보드(23,24)를 보호하기 위해 크고 부피가 큰 하우징을 필요로 하며, 임플란트는 감소된 골화로 인해 어린 마우스에서 더 얇고 덜 단단한, 마우스 두개골에 단단히 부착되어야 한다. 따라서, 생체 내 설치류 생리학에 대한 거의 모든 연구는 상대적인 크기, 강도 및 두개골 두께로 인해 성인 피험자에서 수행되었습니다. 현재까지, 생체 내 청소년 설치류 뇌 생리학을 탐구하는 대부분의 연구는 야생형 청소년 쥐에서 수행되었으며, 이는 인간 장애 25,26,27,28,29,30의 자유롭게 행동하는 모델에서 청소년 뇌 기능을 실험적으로 모니터링하는 능력을 필연적으로 제한합니다.
이 원고는 발달적으로 중요한 기간(p20에서 p60 이상)에 걸쳐 어린 마우스의 장기(최대 4주 이상) 생체 내 뇌 기능을 만성적으로 연구하기 위한 새로운 임플란트 하우징, 외과적 이식 절차 및 수술 후 회복 전략을 설명합니다. 이식 절차는 어린 생쥐의 두개골에 전극을 안정적이고 영구적으로 부착할 수 있도록 합니다. 또한, 마이크로 드라이브 설계는 완전히 조립되었을 때 무게가 ~4-6g이고 임플란트의 무게를 상쇄하는 데 필요한 최소한의 균형으로 인해 일반적인 행동 패러다임 동안 어린 마우스의 행동 성능에 영향을 미치지 않기 때문에 가볍습니다.
설치류에서 생체 내 신경 회로 기능을 탐구하는 현대 실험은 종종 영구적으로 이식된 전극을 통해 세포외 전기생리학을 활용하여 개별 뉴런(즉, 단일 단위) 또는 지역 개체군(국소 전위, LFP를 통해)의 활동을 모니터링하지만 이러한 방법은 기술적인 문제로 인해 어린 마우스에 거의 적용되지 않습니다. 이 원고는 p20에서 p60 및 그 이상의 발달적으로 중요한 창에 걸쳐 마우스에서 생체 내 전기생리학적 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 방법론에는 마이크로 드라이브 임플란트의 인쇄 및 구성을 위한 제조 공정, 외과적 임플란트 절차 및 수술 후 회복 전략이 포함되며, 이 모든 것은 특히 어린 마우스에 사용하도록 맞춤화되었습니다. 이 프로토콜의 개발에는 성인 마우스에 비해 어린 마우스의 작은 크기와 상대적 약점, 마이크로 드라이브를 부착해야 하는 어린 마우스 두개골의 골화 감소를 포함하여 몇 가지 고려 사항이 영향을 미쳤습니다.
생체 내 전기생리학을 수행하기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 주요 방법은 전극(예: 테트로드) 및 실리콘 프로브의 어레이입니다. 실리콘 프로브는 가볍고, 단위 중량 당 많은 수의 기록 부위를 제공할 수 있으며, 이전에 어린 쥐25마리에서 활용되어 왔다. 그러나 실리콘 프로브는 단위당 상대적으로 비쌉니다. 대조적으로, 이 원고에 설명된 마이크로 드라이브는 미화 50달러 미만의 원자재를 사용하여 구성할 수 있으므로 생체 내 기록을 위한 비용 효율적인 옵션입니다. 또한 실리콘 프로브는 종종 고정선에 이식되어야 하므로 공간적으로 다양한 뇌 영역의 기록이 금지됩니다. 대조적으로, 이 원고에 설명된 마이크로 드라이브 설계는 독립적으로 조정 가능한 테트로드를 사용하여 최대 16개의 서로 다른 위치에서 동시 녹음을 수용할 수 있으며 해당 위치 간의 공간적 관계에 대한 거의 제한이 없습니다. 이 마이크로 드라이브 설계는 캐뉼라 구멍 돌출부를 원하는 전방/후방 및 내측/원위 위치로 이동하여 여기에 설명된 것과 다른 위치를 타겟팅할 수 있도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 대체 뇌 영역을 목표로 삼을 때 사극이 종종 직선으로 이동하지만 이러한 가는 와이어가 마이크로 드라이브 캐뉼라를 빠져나갈 때 약간 편향될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 따라서 뇌 영역이 작거나 복부가 많을수록 사극으로 해당 영역을 성공적으로 표적으로 삼는 것이 더 어려워집니다.
이 원고에 기술된 마이크로-드라이브 임플란트는 개별 테트로드가 나사에 부착되어, 각 테트로드의 기록 깊이를 미세하게 제어할 수 있다는 점에서 이전의 여러 테트로드 기반 마이크로-드라이브 설계들(23,32,33,34,35)과 근본적으로 유사하다. 현재 마이크로 드라이브 설계의 몇 가지 기능은 공간적으로 분산된 뇌 영역을 쉽게 표적으로 삼을 수 있다는 점을 포함하여 독특하지만, 현재 원고의 주요 참신함은 외과적 이식 및 수술 후 회복 전략에 대한 설명으로, 이는 아직 발달 중인 어린 마우스의 네트워크 활동에 대한 만성적인 연구를 가능하게 합니다. 실제로, 여기에 설명된 수술 및 회복 방법론은 어린 생쥐의 다른 임플란트를 지원하도록 조정할 수 있습니다.
여러 날에 걸쳐 일관된 기록을 유지하려면 와이어 또는 프로브를 두개골에 단단히 부착해야 합니다. 쥐 두개골의 전체 구조는 p20 이후에 약간의 변화만 겪지만, 두개골은 p20에서 p45 사이에 상당히 두꺼워집니다36. 실제로 p20의 두개골은 손상 없이 부착된 임플란트를 지지하기에 충분히 단단하지 않습니다. 이러한 생물학적 한계를 극복하기 위해 이 프로토콜은 이식 수술 중에 시아노아크릴레이트를 통해 인위적으로 두개골을 두껍게 만듭니다. 이 전략을 사용하여 p20보다 어린 마우스에 이식하는 것이 가능할 수 있지만 마우스 두개골은 대략 p2036까지 상당한 크기와 모양 변화를 겪습니다. 따라서 p20보다 어린 마우스에 장기간 이식하는 것은 아직 발달 중인 두개골의 시아노아크릴레이트 및 고정 뼈 나사가 두개골의 자연적인 성장과 기본 뇌 조직 발달에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 권장되지 않습니다. 중요하게도, 이 연구에서 p20에서 시작하는 만성 이식 후 두개골 또는 뇌 크기의 총 측정에 미치는 영향이 관찰되지 않았다는 것입니다(그림 5C).
이 원고에 설명된 방법의 중요한 단계는 수술 후 회복 전략입니다. 이 전략에 따르면, 임플란트의 무게는 마우스가 성숙하고 근육 및 근골격계 발달을 겪음에 따라 지속적으로 균형을 이루어야 합니다. 이식 후 초기에 마우스는 균형 없이 임플란트의 무게를 성공적으로 견딜 수 없어 마우스가 케이지의 음식과 수원에 적절하게 도달할 수 없기 때문에 영양실조와 탈수로 이어집니다. 카운터 밸런스 시스템은 구성하기 쉽고 저렴하며 구현하기 쉬우며 이식 가능한 모든 연령의 마우스가 홈 케이지 전체를 자유롭게 탐색할 수 있도록 하여 적절한 영양과 수분 공급을 보장합니다. 생쥐가 나이가 들어감에 따라 성인 생쥐에서 완전히 제거 될 수있을 때까지 균형의 양을 줄일 수 있습니다. 그러나 실험 기간 동안 최소한 공칭 균형추를 항상 부착한 상태에서 카운터밸런스 시스템을 계속 사용하는 것이 좋습니다. 성인 마우스는 시간이 지남에 따라 마이크로 드라이브의 크기와 무게를 견딜 수 있지만, 균형추를 개선하지 않고 자유로운 행동 중에 자연스러운 움직임을 계속하면 마이크로 드라이브를 두개골에 고정하는 뼈 나사에 토크와 전단력이 발생하여 특히 더 긴 만성 실험 중에 분리될 가능성이 높아집니다.
현재 연구에서 주목해야 할 두 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 첫째, p20에서의 이식이 두개골과 뇌 발달에 미치는 영향을 평가하기 위해, 장기간 이식 후 여러 마우스의 코호트를 희생시켰다(그림 5C). 이러한 분석은 이식이 두개골 구멍 크기나 뇌 질량에 미치는 유의미한 영향을 나타내지 않았지만(그림 5C), 현재 연구에서는 p20-p60의 초기 발달 기간 동안 여러 시점에서 두개골 크기나 뇌 질량을 조사하지 않았습니다. 선행 연구에서는 뇌강의 발달이 p2036에 의해 완료됨을 보여주지만, 이 초기 창에서의 이식은 여기에서 평가된 성인 연령에 의해 수정되거나 보상되는 예상치 못한 변화를 일으킬 수 있습니다. 둘째, 도 3 및 도 4 에 도시된 전기생리학적 데이터를 생성한 실험은 세포 수율을 최대화하도록 설계되지 않았다. 따라서 여기에 제시된 데이터는 안정적이고 만성적인 기록과 잘 분리된 단일 장치를 보여주지만 이 장치의 최대 잠재적 수율을 나타내는 것으로 간주해서는 안 됩니다.
많은 인간의 신경 및 정신 장애는 자폐증 및 정신 분열증을 포함하여 초기 발달 기간 또는 청소년기에 걸쳐 나타납니다. 그러나 사용 가능한 마우스 모델이 많음에도 불구하고 이러한 질병의 기초가 될 수 있는 회로 수준 기능 장애에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 이러한 초기 네트워크 변화의 식별은 조기 발견 전략 및 치료 패러다임을 만드는 데 중요합니다. 그러나 기술적 문제로 인해 신경 정신 질환의 마우스 모델 개발 전반에 걸쳐 네트워크 기능이 어떻게 중단되는지는 불분명합니다. 여기에 설명된 마이크로 드라이브 및 복구 전략은 마우스 뇌의 다지역 뇌 네트워크 발달에 대한 조사를 지원하도록 설계되었으며, 따라서 연구자들은 건강한 뇌 발달을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 마우스 질병 모델에서 해당 발달의 변화를 식별할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 National Institutes of Health R01 NS104829 (B.E.P.), R01 MH117149 (L.J.V.) 및 F99NS12053 (L.D.Q.) 및 UT Southwestern GSO Endowment Award (RJP 및 LDQ)의 지원을 받았습니다. 저자는 기술 지원에 대해 Jenny Scaria (Texas Tech University Health Sciences Center School of Pharmacy)와 방법 론적 제안에 대해 Brendon Watson 박사 (University of Michigan)에게 감사드립니다.
10 V video tracking LEDs | Neuralynx | HS-LED-Red/Green-omni-10V | For use with headstage pre-amplifiers that contain LED sockets for movement tracking purposes |
16TT EIB Board | Neuralynx | EIB-36-16TT | Electronic interface board- omnetics connector |
16TT headstage pre-amplifier | Neuralynx | HS-36-LED | Omnetics 44 socket signal amplifier between EIB board and tether cable for recording applications; includes connectors for headstage LEDs for movement tracking purposes |
Baby-Mixter hemostat | FST | 13013-14 | Fine curved hemostat |
Bone anchor screw | Stoelting | 51457 | Used to attach EIB board to main drive body |
Burpenorphine | ZooPharm | Lot #BERLAB0.5-221207 | Burpenorphine (0.5 mg/mL) 5mL quantity |
Cable tether | Neuralynx | HS-36 Litz Tether | Lightweight shielded wire tether for omnetics headstages; length options of 1 m/2 m/3 m/5 m |
Carprofen/Rimadyl | Bio-Serve | MD150-2 | Post-operative anti-inflammatory agent |
Clear resin v4 | Formlabs | FLGPGR04 | Liquid resin that is photopolymerized by 3D printer during the 3D printing process |
Custom (shuttle) screw | Advanced Machining and Tooling, Inc. | Custom | Machined and threaded custom screws |
Dental acrylic liquid component | Teets denture material | Lot# 329801 | liquid component of denture material (see above) |
Dental acrylic powder component | Teets denture material | Lot# 583987 | "cold cure" denture material, methyl methacrylate; mixed with liquid component for application to secure recording device in place |
DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | High calorie dietary supplement for young/recovering mice |
Digital Lynx 16SX | Neuralynx | DigitalLynx 16SX Base | Main recording apparatus with 16 combo board slots for up to 512 recording channels |
Dissector scissors- heavy blades | FST | 14082-09 | Various |
Dumont #5 ceramic coated forceps | FST | 11252-50 | Tetrode handling/threading/pinning |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose assembly use |
Dumont #5SF forceps | FST | 11252-00 | Multipurpose surgical use |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Various |
Dumont #7 fine forceps (curved) | FST | 11274-20 | Multipurpose surgical use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Plating/assembly use |
EIB-36 plating adapter | Neuralynx | EIB-36 plating adapter | Stereotactic accessory for lowering drive onto skull during surgery |
Euthasol | Virbac | 710101 | Pentobarbital sodium for euthanasia |
Extra fine Bonn scissors | FST | 14083-38 | Various |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Extra fine graefe forceps | FST | 11150-10 | Small straight serrated forceps |
Fine hemostats | FST | 13006-12 | Fine hemostats |
Fine scissors- CeramaCut | FST | 14958-09 | Tetrode cutting |
Fine scissors- ToughCut | FST | 14058-09 | Various |
Form 3+ | Formlabs | PKG-F3-P-WS-SVC-BASIC | 3D printer for fabrication of all printed parts/materials; low-force stereolithography 3D printer (LFS) |
Gel super glue | Loctite | 1363589 | Various steps |
Graefe forceps | FST | 11049-10 | Small angled serrated forceps |
Ground wire | A-M Systems | Lot# 582335 | Stainless steel bare wire, .005" diameter, annealed, 100 feet |
Hair removal gel | Generic | Commercially available | For pre-op removal of hair from top of mouse head |
Heat gun | Dewalt | D26960K | Tetrode fusion following spinning |
High temperature cautery kit | FST | 18010-00 | For use with bone wax if applicable |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | Electrical sterilization apparatus for ad hoc instrument sterilization during surgical procedures |
Isoflurane | Covetrus | 11695067771 | Standard isoflurane liquid anesthsia for use in isoflurane vaporizer to max 5% |
Isopropyl alcohol 91% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
Jewelry screw (bone screws for juvenile mice) | Component supply co. | MX-000120-02SFL | S/S machine screw #000-120 x 1/8'' filister head, slotted drive |
LaGrange scissors | FST | 14173-12 | Various |
Large polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 13564 | Polyimide tubing- inner diameter 0.0071"; outer diameter 0.0115"; length 36" |
Liquid super glue | Loctite | 1365882 | Various steps |
Micro drill | Foredom | K.1070 | K.1070 high speed rotary micromotor kit; with control box, 3/32" collet, variable speed foot control, handpiece cradle; stereotactically fittable; 100–115 V use |
Micro drill burr (0.5 mm+) | FST | 19007-05/07/09 | Craniotomy |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | Various steps |
Mineral oil | Sigma | Pcode 1002076577; M5904-500mL | For use keeping craniotomy holes open |
Miniature flathead screwdriver | FST | 30051-10 | Insertion/tightening of bone screws |
Neosporin Triple Antibiotic Ointment | Johnson & Johnson | 512373700 | Antibiotic ointment |
Omnetics 44 socket nano connector | Neuralynx | Neuralynx part #A70427-801 | NONSTANDARD ITEM- omnetics 44 socket (female) dual row straight leg nano connector with 2 guide pins (male) for use with custom-made counterbalance apparatus |
Platinum 10% iridium wire | California fine wire | MO# M374710 | Fine recording wire spun into tetrodes for use during recording by use of the terode assembly station and spinner 2.0 (see below); HML NATRL VG BOND COAT; SIZE .0007 X 200FT |
Platinum black plating solution | Neuralynx | Platinum black plating solution | Plating |
Polycarbonate cage bottom | Thomas Scientific/Maryland plastics | 1113M35; mfr. No. E0270 | Standard cage bottom; can be fitted with wire mesh apparatus over top that contains chow+water bottle for unimplanted mice |
Polycarbonate cage top with N10 micro filter | Ancare | N/A | Standard cage top to be modified with PVC pipe for counterbalance apparatus |
Povidone iodine 10% | Generic | Commercially available | For standard pre-operative sterilization procedure |
PVC pipe | Charlotte pipe | N/A | 1/2" x 600 PSI schedule 40 white PVC pipe; for use/assembly into counterbalance apparatus during mouse recovery |
Scalpel blades- #4 | FST | 10060-00 | Incision use |
Scalpel handle- #4 gross anatomy | FST | 10060-13 | Incision use |
Self-holding pin and bone screw forceps | FST | 26100-00 | Holder for bone and ground screws while inserting into skull |
Small EIB pins | Neuralynx | Small EIB pins | Attachment of tetrode wires to EIB board |
Small polyimide tubing | Nordson medical | Lot # 19102423 | Polyimide tubing- inner diameter 0.004''; outer diameter 0.0044''; length 36" |
SolidWorks | Dassault Systemes | SolidWorks | 3D CAD program for micro-drive design |
Spatula and probe | FST | 1090-13 | Applicator for petroleum jelly/mineral oil + optional use for ad hoc tetrode straightening |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Scissors for cranial tissue incisions |
Spring scissors- 8 mm | FST | 15024-10 | Initial incisions |
Standard pattern forceps | FST | 11000-12 | Large serrated forceps |
Surgical scissors- sharp-blunt | FST | 14001-12 | Various |
Surgical scissors- ToughCut | FST | 14054-13 | Various |
Tetrode assembly station | Neuralynx | Tetrode assembly station | Tetrode Assembly |
Tetrode spinner 2.0 | Neuralynx | Tetrode spinner 2.0 | Tetrode Assembly |
Two-part epoxy | Gorilla brand | 4200102 | Various steps |