우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.
현재 오가노이드 배양은 다양한 장기의 다양한 생물학적 측면과 질병에 대한 시험관 내 연구를 위한 중요한 도구입니다. 쥐 소장 선와(small intestinal crypt)는 3D 세포외 기질(extracellular matrix)에서 배양될 때 장 상피를 모방하는 오가노이드(organoid)를 형성할 수 있습니다. 오가노이드는 다양한 장 항상성 기능을 수행하는 모든 세포 유형으로 구성됩니다. 여기에는 Paneth 세포, 장 내분비 세포, 장 세포, 잔 세포 및 술 세포가 포함됩니다. 잘 특성화된 분자를 배양 배지에 첨가하여 G 단백질 결합 수용체 5를 포함하는 류신이 풍부한 반복으로 표지된 장 줄기 세포(ISC)를 풍부하게 하고 특정 계통을 따라 분화를 유도하는 데 사용됩니다. 이러한 분자에는 표피 성장 인자, Noggin(뼈 형태 형성 단백질) 및 R-spondin 1이 포함됩니다. 또한 단일 에리스로포이에틴 생성 간세포 수용체 B2(EphB2) 양성 ISC에서 오가노이드를 생성하는 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다. 이 방법 기사에서는 조직에서 소장 선와와 단일 ISC를 분리하고 오가노이드의 효율적인 확립을 보장하는 기술에 대해 설명합니다.
2009년에 처음 설립된 장 오가노이드는 성숙한 조직과의 형태학적 및 기능적 유사성을 감안할 때 장 생물학을 연구하기 위한 강력한 체외 도구로 부상했습니다. 최근 성체 조직 줄기 세포에서 유래한 배양 오가노이드의 기술 발전으로 자가 재생 및 분화 가능성이 있는 장 줄기 세포(ISC)의 장기 배양이 가능해졌습니다. 이러한 오가노이드는 위장 생리학 및 병태생리학 1,2,3,4,5,6에 대한 기초 및 중개 연구에 널리 사용되었습니다. Clevers 그룹이 개발한 3D 오가노이드는 생리학적 관련성이 향상된 장 상피를 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다7. 장 오가노이드는 조직 줄기 세포에서 유래하고 여러 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에 장 상피의 기능을 요약합니다. 주목할 점은, 단일 분류된 류신이 풍부한 반복 물질 함유 G 단백질 결합 수용체 5-양성(Lgr5+) 줄기 세포는 또한 Paneth 세포 또는 상피 틈새 또는 기질 틈새와 같은 ISC 틈새 없이 3D 오가노이드를 생성할 수 있다는것이다 7. 그러나, 단일 분류된 Lgr5+ 세포의 오가노이드 형성 능력은 crypt 및 ISC-Paneth celldoublet의 오가노이드 형성 능력에 비해 낮다8.
점점 더 많은 연구에서 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 배양 또는 콜라게나 제 해리 방법이 상피의 풀림과 지하실의 방출을 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다. 효소 해리는 선와(crypt)의 세포 상태에 영향을 미칠 수 있으므로 일반적으로 조직을 해리하기 위해 기계적 분리 방법이 사용됩니다. 기계적 소화는 빠른 기술이지만, 이 방법은 일관성 없는 선와(crypt) 수율 또는 낮은 세포 생존율과 관련이 있을 수 있다9. 그러므로, EDTA 처리 및 기계적 해리는 더 나은 crypt 수율을 생성하기 위해 결합될 수 있습니다. 이 기사에 제시된 방법론의 특징은 EDTA 킬레이트화 후 조직 조각의 격렬한 진탕을 사용하는 것입니다10. 격렬한 흔들림은 소장의 crypt-villus 복합체에서 crypt를 효율적으로 격리 할 수 있습니다. 수동 흔들림의 정도에 따라 분리가 결정됩니다. 따라서 복합체에서 지하실을 얻는 것은 이 분야의 실험자에게 중요합니다. 또한 적절한 기술은 융모 오염을 최소화하고 지하실의 수를 늘릴 수 있습니다.
따라서 쥐 유래 소장 오가노이드를 사용하는 이 실험 프로토콜은 해리를 위해 EDTA로 처리한 후 물리적 힘으로 지하실을 더 잘 분리할 수 있습니다. 에리스로포이에틴 생성 간세포 수용체 B2(EphB2)의 발현 패턴은 부분적으로 선와 환경을 반영하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, EphB2 양성 세포는 아래에서 위로 조직화된다11. EphB2 발현을 기초로 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행하였고, 얻어진 세포를 EphB2high, EphB2med, EphB2low 및 EphB2neg의 4개 그룹으로 나누었다. 이어서, 야생형(WT) 마우스에서 단일 분류된 EphB2고 세포로부터의 오가노이드 성장이 입증되었다.
이 프로토콜은 소장 선와를 일관되게 분리하고 3D 오가노이드의 후속 배양을 설명하는 방법을 설명합니다. 지하실 방출 속도를 향상시키기 위해 EDTA 치료 후 격렬한 흔들림을 포함하는 기계적 격리 방법이 확립되었습니다. 배지 조성은 Sato et al.7의 원래 프로토콜과 다릅니다. 원래 매체는 상대적으로 비쌉니다. 따라서, 약리학적 억제제, 재조합 성장 인자 및/또는 컨디셔닝 배지를 함유하는 쥐 소장 오가노이드에 대한 배양 배지 및 맞춤형 배지가 표 1에 나와 있습니다. Wnt3A 및 N-아세틸시스테인은 이 프로토콜의 배양 배지에 포함되지 않습니다. Paneth 셀이 Wnt3를 발현함에 따라 셀은 Wnt3를 생성하고 ISC 유지를 지원합니다. 또한 크립트 격리 과정에서 컨디셔닝된 매체는 사용되지 않습니다. 오가노이드 모델은 동적이며 세포 및 구조적 이질성(파네스 세포, 장세포, 잔 세포, 장내분비 세포, 술 세포 및 ISC)을 가지고 있습니다. 따라서 이러한 오가노이드는 오가노이드 생물학의 근본적인 문제를 연구하는 데 대규모로 사용할 수 있습니다.
EphB2 구배는 성인 소장에서 섬와-융모 축을 따라 ISC 줄기 및 증식을 유지한다18. 분리된 선와와 비교하여 단일 EphB2 세포에서 오가노이드를 만드는 이점은 ISC가 다양한 인간 장 질환에서 핵심적인 역할을 하기 때문에 쥐 ISC의 생물학을 이해하는 것과 관련이 있습니다. 단일 EphB2 고발현 ISC는 단일 Lgr5발현 ISC에서 오가노이드를 개발하는 것과 유사한 방식으로 배양하여 오가노이드를 형성할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 FACS를 이용하여 정밀하게 세포들을 크립트에서의 EphB2 발현에 따라 4개의 그룹(EphB2high, EphB2 med, EphB2low, 및 EphB2neg)으로 나누는 것이다. 전방 대 측면 산란(FSC 대 SSC) 플롯은 일반적으로 크기와 입도에 따라 관심 있는 세포를 식별하는 데 사용됩니다. FSC는 셀 크기를 나타내고, SSC는 P0 게이트에서 셀의 복잡성 또는 세분성과 관련된다(도 2A). 이 작업에서, 정의된 게이트(P0) 내에 속하는 세포는 후속적으로 생존력에 대해 분석되었습니다. 다음으로, 이들의 생존력은 7-AAD 형광 신호의 음성 및 양성 집단에 따라 결정되었습니다. 7-AAD 음성 세포와 -양성 세포 사이의 경계는 최소한의 양성 세포 오염으로 음성 세포를 얻기 위해 엄격하게 결정되었습니다. EphB2 게이트는 EphB2 등급 발현에 기초하여 대략적으로 설정되었다.
4개의 군을 정밀하게 구분한 것을 확인하기 위해, 선별된 유전자의 mRNA 발현을 분석하였다. ISC 마커의 mRNA 수준은 EphB2세포 에서 높게 나타난다20. 또한, 전구 세포 특이적 마커의 mRNA 수준은 EphB2med 세포에서 상대적으로 높다20. 그러나, EphB2낮음 및 EphB2neg 세포에서의 EphB2 exdpression은 EphB2high 및 EphB2med 세포20에 비해 낮거나 음성이다. 도금 전에 EphB2고 세포 집단의 농축을 보장하기 위해 선행 조치를 취해야 합니다. 그러나, EphB2고 세포에서 6% 미만의 오가노이드 성장은 자와분리 동안 격렬한 진탕이 아니라 배양 과정 동안 줄기세포의 사멸에 기인할 수 있다. 인간 배아 줄기 세포에 선택적 Rho-associated kinase(ROCK) 억제제를 적용하면 해리 유도 세포자멸사가 현저히 감소하는 것으로 나타났습니다22. 따라서, 기술적 변화로서, 생존력을 향상시키기 위해 더 높은 농도와 더 긴 배양으로 ROCK 억제제를 첨가하는 것이 가치가 있다.
ISC 옆에 있는 Wnt3A-분비 파네스 셀은 ISC에 필수적인 지지를 제공한다(8). 실제로, ISC-Paneth 세포 이중선은 단일 ISC에 비해 크게 증가된 오가노이드 형성 능력을 나타낸다8. 또한, 배양 첫 3일 동안 100ng/mL 농도의 Wnt3A를 첨가하면 오가노이드 형성 능력이 증가하는 것으로 나타났다8. 따라서 또 다른 기술적 변화로 외인성 Wnt3A를 추가하면 단일 EphB2고발현 ISC의 오가노이드 형성 능력이 향상될 수 있습니다.
생체 내 접근법에 비해 오가노이드는 유전자 조작, 악성 표현형 분석 및 약물 스크리닝에 쉽게 사용할 수 있습니다20,23. EDTA 킬레이트화와 기계적 분리 방법의 조합은 선와에서 소장 오가노이드를 생성하는 데 효과적이고 재현 가능하며 시간 효율적이며 고급 경험이 없어도 실험실 직원이 쉽게 따를 수 있습니다. 따라서, EDTA로 치료한 후 격렬한 진탕을 통한 기계적 단리를 추가하면 생체 외에서 쥐 소장 오가노이드를 효율적으로 확립할 수 있고 다른 성인 상피 조직의 오가노이드 배양 및 질병 모델링을 위한 잠재적인 도구를 제공할 수 있습니다.
장 상피 세포는 분극화되고 정점 측면이 내강을 향하도록 배향됩니다. 그러나 3D 오가노이드의 루멘을 향한 정점 면은 내부에 있습니다. 따라서 이 조직은 영양분, 미생물 및 대사 산물과 같은 내강 성분이 상피 세포에 미치는 영향을 연구할 때 문제가 되는 정점 측면에 대한 접근을 방지합니다. 이러한 단점을 피하기 위해, 오가노이드 세포를 2D 단층으로 배양하는 방법이 개발되었다24. 미래의 응용 측면에서 오가노이드 세포 단층의 배양은 가장 효율적이고 다루기 쉬운 시스템을 나타내기 때문에 활용될 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업은 T.T.(보조금 번호 JP17K07495 및 JP20K06751)에 대한 과학 연구 보조금(C)의 지원을 받았습니다. 장기 타임랩스 이미징(LCV100; 올림푸스).
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |