אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.
כיום, תרבית אורגנואידים מהווה כלי חשוב לחקר חוץ גופי של היבטים ביולוגיים שונים ומחלות באיברים שונים. קריפטים של המעי הדק יכולים ליצור אורגנואידים המחקים את אפיתל המעי כאשר הם מתורבתים במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית. האורגנואידים מורכבים מכל סוגי התאים הממלאים פונקציות הומיאוסטטיות שונות במעי. אלה כוללים תאי Paneth, תאים enteroendocrine, enterocytes, תאי גביע, ותאי tuft. מולקולות מאופיינות היטב מתווספות למדיום התרבית כדי להעשיר את תאי הגזע של המעי (ISC) המסומנות בחזרות עשירות בלאוצין המכילות קולטן מצומד לחלבון G 5 ומשמשות להנעת התמיינות לאורך שושלות ספציפיות; מולקולות אלה כוללות גורם גדילה אפידרמלי, Noggin (חלבון מורפוגנטי עצם), ו- R-spondin 1. בנוסף, מפורט פרוטוקול ליצירת אורגנואידים מקולטן הפטוצלולרי B2 (EphB2)-חיובי יחיד המייצר אריתרופואיטין. במאמר שיטות זה מתוארות טכניקות לבידוד קריפטים של המעי הדק ו- ISC יחיד מרקמות והבטחת הקמה יעילה של אורגנואידים.
אורגנואידים במעי, שהוקמו לראשונה בשנת 2009, התגלו ככלי רב עוצמה במבחנה לחקר ביולוגיה של המעי בהתחשב בדמיון המורפולוגי והתפקודי שלהם לרקמות בוגרות. לאחרונה, התקדמות טכנולוגית באורגנואידים בתרבית שמקורם בתאי גזע של רקמה בוגרת אפשרה תרבית ארוכת טווח של תאי גזע במעי (ISC) עם פוטנציאל התחדשות עצמית והתמיינות. אורגנואידים אלה נמצאים בשימוש נרחב במחקרים בסיסיים ותרגומיים על פיזיולוגיה של מערכת העיכול ופתופיזיולוגיה 1,2,3,4,5,6. אורגנואידים תלת ממדיים שפותחו על ידי קבוצת Clevers מספקים כלי רב עוצמה לחקר אפיתל המעי עם רלוונטיות פיזיולוגית משופרת7. מכיוון שאורגנואידי מעיים נגזרים מתאי גזע רקמתיים ומורכבים מסוגי תאים מרובים, הם משחזרים את הפונקציונליות של אפיתל המעי. יש לציין כי תא גזע 5-חיובי (Lgr5+) קולטן 5-חיובי (Lgr5+) הממוין יחיד עשיר בלאוצין ומכיל קולטן מצומד לחלבון G (Lgr5+) יכול גם לייצר אורגנואידים תלת-ממדיים ללא תאי Paneth או נישה ISC כגון נישה אפיתל או נישה סטרומלית7. עם זאת, יכולת יצירת האורגנואידים של תאי Lgr5+ ממוינים בודדים נמוכה בהשוואה לאלה של קריפטה ותא ISC-Paneth כפול8.
מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי שיטות הדגירה של חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) או דיסוציאציה של collagenase גורמות להתרופפות באפיתל ולשחרור קריפטות. מכיוון שלדיסוציאציה אנזימטית עשויה להיות השפעה על מצב התא של קריפטים, שיטת בידוד מכנית משמשת בדרך כלל לניתוק הרקמה. למרות שעיכול מכני הוא טכניקה מהירה, שיטה זו יכולה להיות קשורה לתפוקות קריפטה לא עקביות או לכדאיות תאים ירודה9. לכן, טיפול EDTA ודיסוציאציה מכנית יכולים להיות משולבים כדי לייצר תפוקות קריפטה טובות יותר. מאפיין של המתודולוגיה המוצגת במאמר זה הוא השימוש בטלטול נמרץ של שברי הרקמה לאחר כלציה EDTA10. טלטול נמרץ מאפשר בידוד יעיל של קריפטים ממתחמי קריפט-וילוס במעי הדק. מידת הרעידה הידנית קובעת את ההפרדה. לכן, קבלת crypts מקומפלקסים חשוב עבור נסיינים בתחום זה. בנוסף, מיומנות נכונה יכולה להפחית את זיהום villus למינימום ולהגדיל את מספר crypts.
לפיכך, פרוטוקול ניסיוני זה, המשתמש באורגנואידים של המעי הדק שמקורם במורין, יכול לבודד טוב יותר קריפטות עם כוח פיזי לאחר טיפול ב- EDTA לדיסוציאציה. ידוע כי דפוס הביטוי של קולטן הפטוצלול B2 (EphB2) המייצר אריתרופואיטין משקף בחלקו את סביבת הקריפטה. לדוגמה, תאים חיוביים ל- EphB2 מאורגנים מלמטה ל-11 העליונים. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בוצע על בסיס ביטוי EphB2, והתאים שהתקבלו חולקו לארבע קבוצות: EphB2גבוה, EphB2med, EphB2נמוך, ו EphB2neg. לאחר מכן, הודגמה צמיחה אורגנואידית מתאיםגבוהים מסוג EphB2 חד-ממוין בעכברי בר (WT).
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד עקבי של קריפטים במעי הדק ואת התרבית הבאה של אורגנואידים תלת-ממדיים. כדי לשפר את קצב שחרור הקריפטה, נקבעה שיטת בידוד מכנית הכוללת טלטול נמרץ לאחר הטיפול ב- EDTA. הרכב המדיום שונה מהפרוטוקול המקורי של Sato et al.7. המדיום המקורי יקר יחסית. לפיכך, מדיום תרבית ומדיה מותאמת אישית לאורגנואידים של המעי הדק המכילים מעכבים פרמקולוגיים, גורמי גדילה רקומביננטיים ו / או מדיה מותנית מוצגים בטבלה 1. Wnt3A ו-N-אצטיל-ציסטאין אינם כלולים במדיום התרבית בפרוטוקול זה. כאשר תאי Paneth מבטאים Wnt3, התאים מייצרים Wnt3 ותומכים בתחזוקת ISC. בנוסף, במהלך בידוד קריפטה, המדיום המותנה אינו בשימוש. מודל האורגנואידים הוא דינמי ובעל הטרוגניות תאית ומבנית (תאי פאנת, אנטרוציטים, תאי גביע, תאים אנטרואנדוקריניים, תאי ציץ ותאי ISC). לפיכך, אורגנואידים אלה יכולים לשמש בקנה מידה גדול כדי לחקור סוגיות בסיסיות של ביולוגיה אורגנואידים.
שיפוע EphB2 שומר על גזע ISC והתפשטות לאורך ציר הקריפט-וילוס במעי הדק הבוגר18. היתרון של ייצור אורגנואידים מתא EphB2 יחיד בהשוואה לקריפטות מבודדות קשור להבנת הביולוגיה של ISCs מורינים, שכן ISCs ממלאים תפקידי מפתח בהפרעות מעיים אנושיות שונות. ניתן לתרבית ISCs יחידים בעלי ביטויגבוה של EphB2 ליצירת אורגנואידים באופן דומה להתפתחות אורגנואידים מספקי ISC בודדים המבטאים Lgr5. השלב החשוב ביותר הוא לחלק במדויק את התאים לארבע קבוצות (EphB2גבוה, EphB2med, EphB2נמוך ו- EphB2neg) על פי ביטוי EphB2 בקריפטות באמצעות FACS. תרשימי פיזור קדימה לעומת צד (FSC לעומת SSC) משמשים בדרך כלל לזיהוי תאים מעניינים בהתבסס על גודלם וגרעיניותם. FSC מציין את גודל התא, ו-SSC מתייחס למורכבות או לגרעיניות של התא בשער P0 (איור 2A). בעבודה זו, התאים שנפלו בתוך השער המוגדר (P0) נותחו לאחר מכן לכדאיות. לאחר מכן, הכדאיות שלהם נקבעה על פי האוכלוסיות השליליות והחיוביות של אותות פלואורסצנטיים 7-AAD. הגבול בין 7-AAD-שלילי ו -חיובי הוחלט בהחלט כדי להשיג את אלה שליליים עם זיהום תאים חיובי מינימלי. שערי EphB2 נקבעו באופן גס בהתבסס על הביטוי המדורג EphB2.
כדי לאשר שארבע הקבוצות חולקו במדויק, נותח ביטוי ה-mRNA של גנים נבחרים. רמות ה-mRNA של סמני ISC גבוהות בתאי EphB2גבוהים 20. בנוסף, רמות ה-mRNA של סמנים ספציפיים לתאי אב גבוהות יחסית בתאירפואה מסוג EphB220. עם זאת, דיכוי EphB2 בתאי EphB2נמוך ותאי EphB2 neg נמוך או שלילי בהשוואה לזה של EphB2גבוה ותאיEphB2 med 20. יש לנקוט בצעדים הקודמים כדי להבטיח את העשרת אוכלוסיית התאיםהגבוהה EphB2 לפני הציפוי. עם זאת, גידול אורגנואידים של פחות מ -6% מתאיםגבוהים EphB2 עשוי להיות תוצאה של מוות של תאי גזע במהלך תהליך התרבית, לא רעידות נמרצות במהלך בידוד קריפטה. הוכח כי היישום של מעכב קינאז סלקטיבי הקשור ל-Rho (ROCK) על תאי גזע עובריים אנושיים מפחית במידה ניכרת אפופטוזיס המושרה על ידי דיסוציאציה22. לכן, כשינוי טכני, כדאי לנסות להוסיף את מעכב ROCK בריכוז גבוה יותר ועם דגירה ארוכה יותר כדי לשפר את הכדאיות.
תאי Paneth מפרישי Wnt3A לצד ISCs מספקים תמיכה חיונית ל-ISCs8. ואכן, מכפילי תאי ISC-Paneth מציגים יכולת יצירת אורגנואידים מוגברת מאוד בהשוואה לתאי ISC בודדים8. יתר על כן, תוספת של Wnt3A בריכוז של 100 ננוגרם/מ”ל במשך 3 הימים הראשונים של התרבית הוכחה כמגדילה את יכולת יצירת האורגנואידים8. לכן, כשינוי טכני נוסף, הוספת Wnt3A אקסוגני יכולה לשפר את יכולת יצירת האורגנואידים של ISCs יחידים בעלי ביטויגבוה של EphB2.
בהשוואה לגישות in vivo, אורגנואידים יכולים לשמש בקלות למניפולציה גנטית, ניתוח פנוטיפים ממאירים, ובדיקת תרופות20,23. שילוב של כלציית EDTA ושיטת בידוד מכנית הוא יעיל, ניתן לשחזור וחסכוני בזמן ליצירת אורגנואידים במעי דק מקריפטות וניתן לעקוב אחריו בקלות על ידי צוות המעבדה ללא כל ניסיון מתקדם. לפיכך, תוספת של בידוד מכני עם רעד נמרץ לאחר הטיפול עם EDTA יכול ביעילות לבסס מורין אורגנואידים במעי דק ex vivo ולספק כלי פוטנציאלי לטיפוח אורגנואידים ומידול מחלות של רקמות אפיתל בוגרות אחרות.
תאי אפיתל המעי מקוטבים ומכוונים כאשר הצד האפי מכוון לכיוון הלומן. עם זאת, הצד האפי מול לומן של אורגנואידים 3D הוא הפנים שלהם. לפיכך, ארגון זה מונע גישה לצד האפיקאלי, שהוא בעיה כאשר לומדים את ההשפעות של רכיבים לומינליים, כגון חומרים מזינים, חיידקים ומטבוליטים על תאי אפיתל. כדי לעקוף את החיסרון הזה, פותחה תרבית של תאים אורגנואידים כחד-שכבות דו-ממדיות24. במונחים של יישומים עתידיים, תרבית של חד-שכבות תאים אורגנואידים תנוצל, מכיוון שהיא מייצגת את המערכת היעילה והניתנת למשיכה ביותר.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בסיוע למחקר מדעי (C) ל- T.T. (מספרי מענקים JP17K07495 ו- JP20K06751). אנו מודים לפרופ’ מינקו קנגאקו על השימוש בציוד לדימות בהילוך ארוך טווח (LCV100; אולימפוס).
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |