我们描述了一种从隐窝中分离小鼠小肠隐窝和培养肠道3D类器官的方案。此外,我们描述了一种在没有上皮下细胞生态位的情况下从单个肠道干细胞生成类器官的方法。
目前,类器官培养是 体外 研究不同生物学方面和不同器官疾病的重要工具。小鼠小肠隐窝在3D细胞外基质中培养时可以形成类器官,模仿肠上皮。类器官由实现各种肠道稳态功能的所有细胞类型组成。这些包括潘氏细胞、肠内分泌细胞、肠细胞、杯状细胞和簇状细胞。将表征良好的分子添加到培养基中以富集含有G蛋白偶联受体5的富含亮氨酸的重复标记的肠道干细胞(ISC),并用于驱动特定谱系的分化;这些分子包括表皮生长因子,Noggin(一种骨形态发生蛋白)和R-spondin 1。此外,还详细介绍了从单个产生促红细胞生成素的肝细胞受体 B2 (EphB2) 阳性 ISC 生成类器官的方案。在这种方法的文章中,描述了从组织中分离小肠隐窝和单个ISC并确保类器官有效建立的技术。
肠道类器官于2009年首次建立,鉴于其与成熟组织的形态和功能相似性,已成为研究肠道生物学的强大体外工具。最近,源自成体组织干细胞的培养类器官的技术进步使得具有自我更新和分化潜力的肠道干细胞(ISC)的长期培养成为可能。这些类器官已被广泛用于胃肠道生理学和病理生理学的基础和转化研究1,2,3,4,5,6。Clevers小组开发的3D类器官为研究肠上皮提供了强大的工具,提高了生理相关性7。由于肠道类器官来源于组织干细胞,由多种细胞类型组成,因此它们概括了肠上皮的功能。值得注意的是,单分选富含亮氨酸的重复序列含有G蛋白偶联受体5阳性(Lgr5+)的干细胞也可以产生没有任何Paneth细胞或ISC生态位(例如上皮生态位或基质生态位)的3D类器官7。然而,与隐窝和ISC-Paneth细胞双联8相比,单分选Lgr5+细胞的类器官形成能力较低。
越来越多的研究表明,乙二胺四乙酸(EDTA)孵育或胶原酶解离的方法会导致上皮松动和隐窝释放。由于酶解离可能对隐窝的细胞状态有影响,因此通常使用机械分离方法来解离组织。虽然机械消化是一种快速技术,但这种方法可能与不一致的隐窝产量或细胞活力差有关9。因此,EDTA处理和机械解离可以结合起来,产生更好的隐窝产量。本文所示方法的一个特点是在EDTA螯合10后对组织碎片进行剧烈摇动。剧烈摇动允许从小肠中的隐窝绒毛复合物中有效地分离隐窝。手动摇晃的程度决定了分离。因此,从复合体中获得隐窝对于该领域的实验者很重要。此外,适当的技能可以将绒毛污染减少到最低限度,并增加隐窝的数量。
因此,该实验方案采用小鼠来源的小肠类器官,可以在用EDTA处理后更好地分离具有物理力的隐窝进行解离。已知产促红细胞生成素肝细胞受体B2(EphB2)的表达模式部分反映了隐窝环境。例如,EphB2阳性细胞从下到上11个组织。基于EphB2表达进行荧光激活细胞分选(FACS),将获得的细胞分为4组:EphB2高、EphB2中、EphB2低和EphB2阴性。然后,证明了野生型(WT)小鼠中单分选EphB2高细胞的类器官生长。
该协议描述了一种一致分离小肠隐窝和随后培养3D类器官的方法。为提高隐窝释放速率,建立了EDTA处理后剧烈摇晃的机械分离方法。培养基组成与Sato等人的原始方案不同7。原始介质相对昂贵。因此,含有药理抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基的小鼠小肠类器官的培养基和定制培养基如 表1所示。Wnt3A和 N-乙酰半胱氨酸不包括在本协议的培养基中。当Paneth细胞表达Wnt3时,细胞产生Wnt3并支持ISC维持。此外,在隐窝隔离过程中,不使用条件培养基。类器官模型是动态的,具有细胞和结构异质性(潘氏细胞、肠细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞、簇状细胞和 ISC)。因此,这些类器官可以大规模用于研究类器官生物学的基本问题。
EphB2梯度维持成人小肠中沿隐窝绒毛轴的ISC干性和增殖18。与分离的隐窝相比,从单个EphB2细胞制造类器官的优势与了解小鼠ISC的生物学有关,因为ISC在各种人类肠道疾病中起着关键作用。单个EphB2高表达ISC可以培养以形成类器官,其方式类似于从单个表达Lgr5的ISC开发类器官。最重要的一步是使用FACS根据隐窝中的EphB2表达将细胞精确地分为四组(EphB2高,EphB2中,EphB2低和EphB2阴性)。前向散射与侧向散射(FSC 与 SSC)图通常用于根据其大小和粒度识别感兴趣的细胞。FSC 表示单元大小,SSC 与 P0 门中单元的复杂性或粒度相关(图 2A)。在这项工作中,随后分析了落在定义门(P0)内的细胞的活力。接下来,根据7-AAD荧光信号的阴性和阳性群体确定其活力。严格决定7-AAD阴性和阳性细胞之间的边界,以获得阴性细胞,并将阳性细胞污染降至最低。EphB2门大致基于EphB2分级表达式设置。
为了确认这四个组被精确划分,分析了所选基因的mRNA表达。ISC标志物的mRNA水平在EphB2高细胞20中很高。此外,祖细胞特异性标记物的mRNA水平在EphB2医学细胞20中相对较高。然而,与EphB2高和EphB2医疗细胞2相比,EphB2低和EphB2阴性细胞中的EphB2抑制较低或为负20。应采取上述措施,以确保在铺板前富集EphB2高细胞群。然而,EphB2高细胞的类器官生长小于6%可能是由于培养过程中干细胞的死亡,而不是隐窝分离期间的剧烈摇晃。已经表明,将选择性Rho相关激酶(ROCK)抑制剂应用于人类胚胎干细胞可显着减少解离诱导的细胞凋亡22。因此,作为技术变化,值得尝试以更高的浓度和更长的孵育时间添加ROCK抑制剂以提高活性。
ISC旁边的Wnt3A分泌Paneth细胞为ISC提供必要的支持8。事实上,与单个ISC相比,ISC-Paneth细胞双联体显示出强烈增加的类器官形成能力8。此外,在培养的前 3 天添加浓度为 100 ng/mL 的 Wnt3A 已被证明可以增加类器官形成能力8。因此,作为另一项技术变化,添加外源性Wnt3A可以提高单个EphB2高表达ISC的类器官形成能力。
与 体内 方法相比,类器官可以很容易地用于遗传操作、恶性肿瘤表型分析和药物筛选20,23。EDTA螯合法和机械分离方法的组合对于从隐窝中创建小肠类器官是有效、可重复和省时的,并且没有任何高级经验的实验室工作人员可以很容易地遵循。因此,在EDTA处理后加入剧烈振荡的机械分离可以有效地在 体外建立 小鼠小肠类器官,并为其他成人上皮组织的类器官培养和疾病建模提供潜在的工具。
肠上皮细胞极化并定向,顶端侧朝向管腔。然而,面向3D类器官腔的顶端一侧位于其内部。因此,这种组织阻止了对顶端的访问,这在研究管腔成分(如营养物质、微生物和代谢物)对上皮细胞的影响时是一个问题。为了规避这一缺点,已经开发出将类器官细胞培养为2D单层24。就未来的应用而言,将利用类器官细胞单层的培养,因为这代表了最有效和最容易处理的系统。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了T.T.科学研究补助金(C)的支持(资助号JP17K07495和JP20K06751)。我们感谢峰子健学教授使用设备进行长期延时成像(LCV100;奥林巴斯)。
1.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 0030 125.215 | |
5 mL syringe | TERUMO | SS-05SZ | |
15 mL Falcon tube | Iwaki | 2325-015 | |
20 μm cell strainer | Sysmex | 04-004-2325 | |
24-well plate | Iwaki | 3820-024 | |
50 mL Falcon tube | Iwaki | 2345-050 | |
60 mm tissue culture dish | FALCON | 353002 | |
70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
100 mm Petri dish | Iwaki | 3020-100 | |
7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-11004 | |
Anti-EphB2 APC-conjugated antibody | BD Biosciences | 564699 | |
C57BL6/J mice | Japan SLC, Inc. | ||
Clean bench | HITACHI | CCV-1306E | |
Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
EDTA (0.5 mol/L) | Nacalai Tesque | 06894-14 | 2 mM |
FACSMelody | BD Life Sciences-Biosciences | 661762 | |
Fetal bovine serum | Sigma | 173012 | 1% (v/v) |
Fiji (software) | https://fiji.sc/ | ||
Gentamicin (10 mg/mL) | Nacalai Tesque | 16672-04 | 25 μg/mL |
Hammacher laboratory scissor | SANSYO | 91-1538 | |
Incubator | Panasonic | MCO-170-PJ | |
Laboratory tweezer | AS-ONE | 7-164-04 | |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030081 | 2 mM |
Matrigel | BD Biosciences | 354230 | ECM for 3D organoids |
Mouse Anti-Human Lysozyme | LSBio | LS-B8704-100 | |
Murine EGF (20 μg/mL stock solution) | PeproTech | 315-09 | 20 ng/mL |
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 50 U/mL |
Pipetman (10 μL, 20 μL, 200 μL, and 1,000 μL) | GILSON | 1-6855-12, -13, -15, and -16 | |
Recombinant murine Noggin (20 μg/mL stock solution | R&D Systems | 1967-NG-025 | 100 ng/mL |
Recombinant murine R-Spondin 1 (250 μg/mL stock solution) | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/mL |
Sorbitol | Nacalai Tesque | 32021-95 | 2% (w/v) |
TE2000-S (inverted microscope) | Nikon | 24131 | |
Time-lapse image microscope | Olympus | LCV100 | |
TrypLE Express 1x | Gibco | 12605-010 | |
ULVAC | ULVAC KIKO Inc. | 100073 | |
Y-27632 | Fujifilm | 331752-47-7 | 10 μM |