Summary

Инфекция первичных эпителиальных клеток носа, выращенных на границе воздух-жидкость, для характеристики взаимодействия коронавируса человека с хозяином

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

Эпителий носа является основным барьерным узлом, с которым сталкиваются все респираторные патогены. В этой статье мы опишем методы использования первичных эпителиальных клеток носа, выращенных в качестве культур границы раздела воздух-жидкость (ALI), для характеристики взаимодействия коронавируса человека с хозяином в физиологически значимой системе.

Abstract

За последние 20 лет появились три высокопатогенных коронавируса человека (HCoV) – SARS-CoV (2002 г.), MERS-CoV (2012 г.) и SARS-CoV-2 (2019 г.), которые вызвали серьезные кризисы в области общественного здравоохранения. Еще четыре HCoV вызывают значительную часть случаев простуды каждый год (HCoV-NL63, -229E, -OC43 и -HKU1), что подчеркивает важность изучения этих вирусов в физиологически значимых системах. HCoV проникают в дыхательные пути и создают инфекцию в эпителии носа, который является основным местом, с которым сталкиваются все респираторные патогены. Мы используем систему культивирования первичного эпителия носа, в которой образцы носа, взятые у пациентов, выращиваются на границе воздух-жидкость (ALI) для изучения взаимодействия патогена-хозяина в этом важном дозорном участке. Эти культуры повторяют многие особенности дыхательных путей in vivo , включая присутствующие типы клеток, функцию цилиарных мышц и выработку слизи. Мы описываем методы характеристики репликации вируса, тропизма клеток хозяина, вирус-индуцированной цитотоксичности и врожденной иммунной индукции в назальных культурах ALI после инфекции HCoV, используя в качестве примера недавнюю работу, сравнивающую летальные и сезонные HCoV в качестве примера1. Более глубокое понимание взаимодействий между хозяином и патогеном в носу может стать новыми мишенями для противовирусной терапии против HCoV и других респираторных вирусов, которые, вероятно, появятся в будущем.

Introduction

На сегодняшний день выявлено семь коронавирусов человека (HCoV), вызывающих целый ряд респираторных заболеваний2. Распространенные или сезонные HCoV (HCoV-NL63, -229E, -OC43 и -HKU1) обычно связаны с патологией верхних дыхательных путей и вызывают примерно 10–30% случаев простуды ежегодно. Несмотря на то, что это типичный клинический фенотип, ассоциированный с распространенным HCoV, эти вирусы могут вызывать более серьезные заболевания нижних дыхательных путей в группах риска, включая детей, пожилых людей и лиц с ослабленным иммунитетом 3,4. За последние 20 лет появились три патогенных HCoV, которые вызвали серьезные чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, включая тяжелый острый респираторный синдром (SARS)-CoV, ближневосточный респираторный синдром (MERS)-CoV и SARS-CoV-2. Летальные ГЦОФ ассоциируются с более тяжелой патологией дыхательных путей, что наглядно демонстрируется коэффициентом летальности >34%, связанным с БВРС-КоВ (894 случая смерти из более чем 2 500 случаев с момента его появления в 2012 г.)5,6. Важно отметить, что смертельные ГЦОФ также вызывают целый ряд заболеваний дыхательных путей, от бессимптомных инфекций до смертельной пневмонии, как это видно на примере продолжающейся пандемии COVID-197.

HCoV, как и другие респираторные возбудители, проникают в дыхательные пути и устанавливают продуктивную инфекцию в эпителии носа8. Считается, что распространение в нижние дыхательные пути связано с аспирацией из ротовой/носовой полости в легкие, где HCoV вызывают более выраженную патологию нижних дыхательных путей 9,10,11. Таким образом, нос служит начальными воротами для проникновения вируса и является основным барьером для инфекции благодаря своему надежному механизму мукоцилиарного клиренса и уникальным врожденным иммунным механизмам, направленным на предотвращение дальнейшего распространения вируса в нижние дыхательные пути12,13. Например, сообщалось, что эпителиальные клетки носа экспрессируют более высокие, чем в среднем, базальные уровни противовирусных интерферонов и интерферон-стимулированных генов, что указывает на то, что клетки носа могут быть подготовлены к раннему ответу на респираторные вирусы14,15,16.

Ранее мы использовали первичные эпителиальные клетки носа, полученные от пациентов, выращенные на границе раздела воздух-жидкость (ALI), для моделирования взаимодействия HCoV и хозяина в носу, где начинаются инфекции HCoV. Назальные бактериологические исследования ALI являются допускающими как патогенные (SARS-CoV-2 и MERS-CoV), так и распространенные HCoV (HCoV-NL63 и HCoV-229E) и обладают различными преимуществами по сравнению с традиционными линиями эпителиальных клеток дыхательных путей, такими как A549 (клеточная линия аденокарциномы легкого)16,17. После дифференцировки назальные культуры ALI содержат гетерогенную клеточную популяцию и демонстрируют многие функции, ожидаемые от эпителия носа in vivo, такие как механизм мукоцилиарного клиренса18. Клетки носа также имеют преимущества по сравнению с системами культивирования нижних дыхательных путей (такими как эпителиальные клетки бронхов человека, HBECs), поскольку получение эпителиальных клеток носа с помощью цитологической чистки является значительно менее инвазивным по сравнению с использованием таких методов, как бронхоскопия для получения HBECs 19,20,21.

В данной работе описаны методы использования этой назальной системы культивирования ALI для характеристики взаимодействия HCoV с хозяином в эпителии носа. Мы применили эти методы в недавно опубликованных работах для сравнения SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 и HCoV-229E 1,16,17. Несмотря на то, что эти методы и репрезентативные результаты подчеркивают важность изучения HCoV в этой модели клеток носа, система легко адаптируется к другим HCoV, а также к другим респираторным патогенам. Кроме того, эти методы могут быть более широко применены к другим системам культивирования ALI для изучения репликации вируса и клеточного тропизма, а также цитотоксичности и индукции врожденного иммунитета после инфекции.

Protocol

Использование образцов из носа было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Пенсильвании (протокол #800614) и Институциональным наблюдательным советом Филадельфии (протокол #00781). 1. Инфицирование назальных посевов ALI ПРИМЕЧА?…

Representative Results

Репрезентативные рисунки частично адаптированы из данных, которые можно найти в рукописи Otter et al.1. Назальные культуры ALI, полученные от четырех или шести доноров, были инфицированы одним из четырех HCoV (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 и HCoV-229E) в соответствии с протоколами, описанными выше, и…

Discussion

Методы, подробно описанные здесь, описывают систему культивирования первичного эпителия, в которой эпителиальные клетки носа, полученные от пациентов, выращиваются на границе раздела воздух-жидкость и применяются для изучения взаимодействий HCoV с хозяином. После дифференцировки эти н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансируется следующими источниками: Национальные институты здравоохранения (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. и N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. и N.A.C.), Пенсильванский центр исследований коронавирусов и других новых патогенов (S.R.W.), Фонд Лаффи-Макхью (S.R.W. и N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Materials

Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

References

  1. Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
  2. Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
  3. Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
  4. Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
  5. MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
  6. Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
  7. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
  8. Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
  9. Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
  10. Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
  11. Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
  12. Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
  13. Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
  14. Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
  15. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
  16. Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
  17. Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
  18. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  19. Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
  20. Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
  21. Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
  22. Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  23. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
  24. Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
  25. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
  26. Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
  27. Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
  28. Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
  29. Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
  30. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
  31. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
  32. Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
  33. Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).

Play Video

Cite This Article
Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L. H., Weiss, S. R., Cohen, N. A. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (199), e64868, doi:10.3791/64868 (2023).

View Video