Summary

ヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴づけるための空気-液体界面で増殖した初代鼻上皮細胞の感染

Published: September 22, 2023
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Summary

鼻上皮は、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要なバリア部位です。ここでは、空気液界面(ALI)培養物として増殖させた初代鼻上皮細胞を用いて、生理学的に関連性の高いシステムにおけるヒトコロナウイルスと宿主の相互作用を特徴付ける方法について概説します。

Abstract

SARS-CoV(2002年)、MERS-CoV(2012年)、SARS-CoV-2(2019年)の3つの高病原性ヒトコロナウイルス(HCoV)が出現し、過去20年間に重大な公衆衛生上の危機を引き起こしました。毎年、風邪の症例のかなりの部分(HCoV-NL63、-229E、-OC43、-HKU1)がさらに4つのHCoVを引き起こしており、生理学的に関連するシステムでこれらのウイルスを研究することの重要性が強調されています。HCoVは気道に侵入し、すべての呼吸器病原体が遭遇する主要な部位である鼻上皮に感染を確立します。私たちは、患者由来の鼻サンプルを気液界面(ALI)で増殖させる一次鼻上皮培養システムを使用して、この重要なセンチネル部位での宿主と病原体の相互作用を研究しています。これらの培養物は、存在する細胞の種類、繊毛機能、粘液産生など、 in vivo 気道の多くの特徴を再現しています。HCoV感染後の経鼻ALI培養におけるウイルス複製、宿主細胞の向性、ウイルス誘発性細胞傷害性、および自然免疫誘導を特徴付ける方法を、致死性と季節性HCoVを比較した最近の研究を例に説明します1。鼻腔内の宿主と病原体の相互作用に関する理解が深まれば、HCoVやその他の呼吸器系ウイルスに対する抗ウイルス治療薬の新たな標的となる可能性があります。

Introduction

これまでに7種類のヒトコロナウイルス(HCoV)が確認されており、さまざまな呼吸器疾患を引き起こします2。一般的または季節性のHCoV(HCoV-NL63、-229E、-OC43、および-HKU1)は、通常、上気道の病理学に関連しており、毎年一般的な風邪症例の推定10%〜30%を引き起こします。これは一般的なHCoVに関連する典型的な臨床表現型ですが、これらのウイルスは、子供、高齢者、免疫不全の個人など、リスクのある集団でより重大な下気道疾患を引き起こす可能性があります3,4。過去20年間に、重症急性呼吸器症候群(SARS)-CoV、中東呼吸器症候群(MERS)-CoV、SARS-CoV-2の3つの病原性HCoVが出現し、重大な公衆衛生上の緊急事態を引き起こしています。致死的なHCoVは、より重篤な気道病変と関連しており、MERS-CoV症例に関連する致死率>34%(2012年の出現以来、2,500例以上で894例)5,6。致死的なHCoVは、現在進行中のCOVID-19パンデミックに見られるように、無症候性感染症から致死性肺炎まで、さまざまな気道疾患も引き起こすことに注意することが重要です7

HCoVは、他の呼吸器病原体と同様に、気道に入り、鼻上皮に生産的な感染を確立します8。下気道への広がりは、口腔/鼻腔から肺への誤嚥に関連していると考えられており、HCoVはより重大な下気道病状を引き起こします9,10,11。したがって、鼻はウイルス侵入の最初のポータルとして機能し、その強力な粘膜繊毛クリアランス機構と、下気道へのウイルスのさらなる拡散を防ぐことを目的とした独自の自然免疫メカニズムにより、感染に対する主要な障壁となります12,13。例えば、鼻の上皮細胞は、抗ウイルスインターフェロンおよびインターフェロン刺激遺伝子の基底レベルが平均よりも高いことが報告されており、鼻細胞が呼吸器系ウイルスに対する早期応答の準備ができている可能性があることを示しています14,15,16

私たちはこれまで、患者由来の初代鼻上皮細胞を気液界面(ALI)で増殖させ、HCoV感染が始まる鼻のHCoVと宿主の相互作用をモデル化しました。経鼻ALI培養は、病原性(SARS-CoV-2およびMERS-CoV)と一般的なHCoV(HCoV-NL63およびHCoV-229E)の両方に寛容であり、A549(肺腺癌細胞株)などの従来の気道上皮細胞株に比べてさまざまな利点があります16,17。分化後、鼻腔ALI培養物は不均一な細胞集団を含み、粘膜繊毛クリアランス機構など、in vivo鼻上皮に期待される機能の多くを示す18。鼻細胞は、細胞学的ブラッシングによる鼻上皮細胞の獲得は、HBECを達成するための気管支鏡検査などの技術の使用と比較して侵襲性が大幅に低いため、下気道培養システム(ヒト気管支上皮細胞、HBEC)よりも利点もあります19,20,21

この論文では、この鼻腔ALI培養システムを利用して、鼻上皮におけるHCoVと宿主の相互作用を特徴付ける方法について説明します。これらの手法を最近発表された研究に適用し、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E 1,16,17を比較しました。これらの方法と代表的な結果は、この鼻細胞モデルにおけるHCoVの研究を強調していますが、このシステムは他のHCoVや他の呼吸器病原体にも高い適応性を持っています。さらに、これらの方法は、ウイルス複製と細胞向性、ならびに感染後の細胞毒性と自然免疫誘導を調査するために、他のALI培養系により広く適用することができます。

Protocol

鼻標本の使用は、ペンシルベニア大学治験審査委員会(プロトコル#800614)およびフィラデルフィアVA治験審査委員会(プロトコル#00781)によって承認されました。 1. 鼻腔ALI培養の感染 注:臨床検体の取得、および鼻腔ALI培養の増殖と分化は、この論文の範囲外です。初代鼻上皮細胞を培養するための特定の方法は、これらの培養物を利用した最?…

Representative Results

代表的な数値は、Otter et al.1の原稿に見られるデータから部分的に改作されています。4人または6人のドナー由来の経鼻ALI培養物を、上記のプロトコルに従って4つのHCoV(SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63、およびHCoV-229E)のいずれかに感染させ、各ウイルスの平均頂端排出ウイルス力価を 図1Aに示します。これら4つのHCoVはすべて経鼻ALI培養で生産的に複製されま?…

Discussion

ここで詳述する方法は、患者由来の鼻上皮細胞を空気と液体の界面で増殖させ、HCoVと宿主の相互作用の研究に適用する一次上皮培養システムについて説明しています。分化されると、これらの鼻腔ALI培養物は、繊毛細胞、杯細胞、基底細胞が表される不均一な細胞集団や、繊毛と粘液分泌を頑強に鼓動する無傷の粘膜繊毛機能など、 in vivo 鼻上皮の多くの特徴を再現します。この不均…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究には、次の資金源があります:国立衛生研究所(NIH)R01AI 169537(SRWおよびN.A.C.)、NIH R01AI 140442(S.R.W.)、VA Merit Review CX001717(N.A.C.)、VA Merit Review BX005432(S.R.W.およびN.A.C.)、Penn Center for Research on Coronaviruses and other Emerging Pathogens(S.R.W.)、Laffey-McHugh Foundation(S.R.W.およびN.A.C.)、 T32 AI055400 (CJO)、T32 AI007324 (AF)。

Materials

Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

References

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Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L. H., Weiss, S. R., Cohen, N. A. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (199), e64868, doi:10.3791/64868 (2023).

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