Summary

זיהום של תאי אפיתל אף ראשוניים הגדלים בממשק אוויר-נוזל כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

אפיתל האף הוא אתר המחסום העיקרי בו נתקלים כל הפתוגנים הנשימתיים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לשימוש בתאי אפיתל אף ראשוניים שגודלו כתרביות ממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לאפיין אינטראקציות אנושיות בין נגיף הקורונה למארח במערכת רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

Abstract

שלושה נגיפי קורונה אנושיים פתוגניים ביותר (HCoVs) – SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) ו- SARS-CoV-2 (2019) – הופיעו וגרמו למשברים משמעותיים בבריאות הציבור ב -20 השנים האחרונות. ארבעה HCoVs נוספים גורמים לחלק משמעותי ממקרי הצטננות בכל שנה (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ו-HKU1), מה שמדגיש את החשיבות של חקר הנגיפים האלה במערכות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית. HCoVs נכנסים לדרכי הנשימה ויוצרים זיהום באפיתל האף, האתר העיקרי בו נתקלים כל הפתוגנים הנשימתיים. אנו משתמשים במערכת תרבית אפיתל אף ראשונית שבה דגימות אף שמקורן במטופל גדלות בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן באתר זקיף חשוב זה. תרביות אלה משחזרות מאפיינים רבים של דרכי הנשימה in vivo , כולל סוגי התאים הנוכחיים, תפקוד ריסוני וייצור ריר. אנו מתארים שיטות לאפיון שכפול נגיפי, טרופיזם של תאים מארחים, ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי וירוסים והשראת חיסון מולדת בתרביות ALI באף לאחר זיהום HCoV, תוך שימוש בעבודה שנערכה לאחרונה המשווה בין HCoVs קטלני ועונתי כדוגמה1. להבנה מוגברת של אינטראקציות מארח-פתוגן באף יש פוטנציאל לספק מטרות חדשות לטיפולים אנטי-ויראליים נגד HCoVs ונגיפים נשימתיים אחרים שסביר להניח שיופיעו בעתיד.

Introduction

שבעה נגיפי קורונה אנושיים (HCoVs) זוהו עד כה וגורמים למגוון מחלות נשימה2. HCoVs נפוצים או עונתיים (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ו-HKU1) קשורים בדרך כלל לפתולוגיה של דרכי הנשימה העליונות וגורמים לכ-10%-30% ממקרי ההצטננות בשנה. למרות שזהו הפנוטיפ הקליני הטיפוסי הקשור ל- HCoVs הנפוץ, וירוסים אלה יכולים לגרום למחלות משמעותיות יותר בדרכי הנשימה התחתונות באוכלוסיות בסיכון, כולל ילדים, מבוגרים ואנשים מדוכאי חיסון 3,4. שלושה HCoVs פתוגניים הופיעו וגרמו למצבי חירום משמעותיים בתחום בריאות הציבור ב-20 השנים האחרונות, כולל תסמונת נשימה חריפה חמורה (SARS)-CoV, תסמונת הנשימה המזרח תיכונית (MERS)-CoV ו-SARS-CoV-2. HCoVs קטלניים קשורים לפתולוגיה חמורה יותר של דרכי הנשימה, אשר מודגמת בבירור על ידי שיעור התמותה של >34% הקשור למקרי MERS-CoV (894 מקרי מוות מיותר מ -2,500 מקרים מאז הופעתו בשנת 2012)5,6. חשוב לציין כי HCoVs קטלני גורם גם למגוון מחלות בדרכי הנשימה, החל מזיהומים אסימפטומטיים ועד דלקת ריאות קטלנית, כפי שניתן לראות עם מגיפת COVID-19 המתמשכת7.

HCoVs, כמו פתוגנים נשימתיים אחרים, נכנסים לדרכי הנשימה ויוצרים זיהום פרודוקטיבי באפיתל האף8. התפשטות לדרכי הנשימה התחתונות נחשבת קשורה לשאיפה מחלל הפה/אף לריאה, שם HCoVs גורם לפתולוגיה משמעותית יותר של דרכי הנשימה התחתונות 9,10,11. לפיכך, האף משמש כשער הראשוני לכניסה נגיפית והוא המחסום העיקרי לזיהום באמצעות מנגנון פינוי הליחה החזק שלו ומנגנוני החיסון המולדים הייחודיים שמטרתם למנוע התפשטות נגיפית נוספת לדרכי הנשימה התחתונות12,13. לדוגמה, תאי אפיתל האף דווחו כמבטאים רמות בסיסיות גבוהות מהממוצע של אינטרפרונים אנטי-ויראליים וגנים מעוררי אינטרפרון, דבר המצביע על כך שתאי האף עשויים להיות מוכנים לתגובות מוקדמות לנגיפים נשימתיים14,15,16.

בעבר השתמשנו בתאי אפיתל אף ראשוניים שמקורם במטופל שגודלו בממשק אוויר-נוזל (ALI) כדי למדל אינטראקציות HCoV-מארח באף, היכן שמתחילות זיהומי HCoV. תרביות ALI באף מתירניות הן לפתוגניות (SARS-CoV-2 ו-MERS-CoV) והן ל-HCoVs נפוצות (HCoV-NL63 ו-HCoV-229E) ומציעות יתרונות שונים על פני קווי תאי אפיתל מסורתיים של דרכי הנשימה כגון A549 (קו תאי אדנוקרצינומה של ריאות)16,17. לאחר ההתמיינות, תרביות ALI באף מכילות אוכלוסיית תאים הטרוגנית ומציגות רבים מהתפקודים המצופים מאפיתל האף in vivo, כגון מנגנון פינוי ליחה18. לתאי האף יש גם יתרונות על פני מערכות תרבית דרכי נשימה נמוכות יותר (כגון תאי אפיתל סימפונות אנושיים, HBECs), שכן רכישת תאי אפיתל באף באמצעות צחצוח ציטולוגי היא הרבה פחות פולשנית בהשוואה לשימוש בטכניקות כגון ברונכוסקופיה להשגת HBECs 19,20,21.

מאמר זה מתאר שיטות לשימוש במערכת תרבית אף זו כדי לאפיין אינטראקציות HCoV-מארח באפיתל האף. יישמנו שיטות אלה בעבודות שפורסמו לאחרונה כדי להשוות SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ו- HCoV-229E 1,16,17. למרות ששיטות אלה ותוצאות מייצגות מדגישות את המחקר של HCoVs במודל תאי אף זה, המערכת ניתנת להתאמה גבוהה ל- HCoVs אחרים, כמו גם לפתוגנים נשימתיים אחרים. יתר על כן, שיטות אלה יכולות להיות מיושמות באופן רחב יותר במערכות תרבית אחרות של ALI על מנת לחקור שכפול נגיפי וטרופיזם תאי, כמו גם ציטוטוקסיות והשראת חיסון מולדת לאחר זיהום.

Protocol

השימוש בדגימות אף אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פנסילבניה (פרוטוקול # 800614) ומועצת הביקורת המוסדית של פילדלפיה VA (פרוטוקול # 00781). 1. זיהום של תרביות ALI באף הערה: רכישת דגימות קליניות, כמו גם צמיחה והתמיינות של תרביות ALI באף, היא מחוץ לטווח…

Representative Results

הנתונים המייצגים לקוחים חלקית מנתונים שניתן למצוא בכתב היד Otter et al.1. תרביות ALI באף שמקורן בארבעה או שישה תורמים היו נגועות באחד מארבעה HCoVs (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ו-HCoV-229E) לפי הפרוטוקולים שתוארו לעיל, והטיטרים הנגיפיים הממוצעים שנשפכו עבור כל וירוס מתוארים באיור 1A. בע…

Discussion

השיטות המפורטות כאן מתארות מערכת תרבית אפיתל ראשונית שבה תאי אפיתל אף שמקורם במטופל גדלים בממשק אוויר-נוזל ומיושמים בחקר אינטראקציות HCoV-מארח. לאחר התמיינותן, תרביות ALI אפיפיוריות אף אלה משחזרות מאפיינים רבים של אפיתל האף in vivo , כולל אוכלוסייה תאית הטרוגנית עם תאים ריסניים, גביעים ותא?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

למחקר זה יש את מקורות המימון הבאים: המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R01AI 169537 (S.R.W. ו- N.A.C.), NIH R01AI 140442 (S.R.W.), VA Merit Review CX001717 (N.A.C.), VA Merit Review BX005432 (S.R.W. ו- N.A.C.), מרכז פן לחקר וירוסי קורונה ופתוגנים מתעוררים אחרים (S.R.W.), קרן Laffey-McHugh (S.R.W. ו- N.A.C.), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Materials

Alexa Fluor secondary antibodies (488, 594, 647) Invitrogen Various
BSA (bovine serum albumin) Sigma-Aldrich A7906
cOmplete mini EDTA-free protease inhibitor Roche 11836170001
Cytotoxicity detection kit Roche 11644793001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) Gibco 11965-084
DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) Gibco 14190136
DPBS + calcium + magnesium Gibco 14040-117
Endohm-6G measurement chamber World Precision Instruments ENDOHM-6G
Epithelial cell adhesion marker (EpCAM; CD326) eBiosciences 14-9326-82
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM) World Precision Instruments 300523
FBS (Fetal Bovine Serum) HyClone SH30071.03
FV10-ASW software for imaging Olympus Version 4.02
HCoV-NL63 (Human coronavirus, NL63) BEI Resources NR-470
HCoV-NL63 nucleocapsid antibody Sino Biological 40641-V07E
Hoescht stain Thermo Fisher H3570
Laemmli sample buffer (4x) BIO-RAD 1610747
LLC-MK2 cells ATCC CCL-7 To titrate HCoV-NL63
MERS-CoV (Human coronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV), EMC/2012) BEI Resources  NR-44260
MERS-CoV nucleocapsid antibody Sino Biological 40068-MM10
MUC5AC antibody Sigma-Aldrich AMAB91539
Olympus Fluoview confocal microscope Olympus FV1000
Phalloidin-iFluor 647 stain Abcam ab176759
PhosStop easy pack (phosphatase inhibitors)  Roche PHOSS-RO
Plate reader  Perkin Elmer HH34000000 Any plate reader or ELISA reader is sufficient; must be able to read absorbance at 492 nm
RIPA buffer (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; 0.5% deoxycholate; 0.1% SDS; 1% NP40) Thermo Fisher 89990 Can prep in-house or purchase
RNeasy Plus Kit Qiagen 74134
SARS-CoV-2 (SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020) BEI Resources NR-52281
SARS-CoV-2 nucleocapsid antibody Genetex GTX135357
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151100
Type IV β- tubulin antibody Abcam ab11315
VeroCCL81 cells ATCC CCL-81 To titrate MERS-CoV
VeroE6 cells ATCC CRL-1586 To titrate SARS-CoV-2

References

  1. Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120 (2023).
  2. Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
  3. Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
  4. Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282 (2022).
  5. MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022)
  6. Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
  7. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
  8. Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
  9. Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
  10. Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
  11. Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
  12. Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
  13. Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092 (2021).
  14. Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
  15. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118 (2021).
  16. Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119 (2022).
  17. Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
  18. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
  19. Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924 (2012).
  20. Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259 (2019).
  21. Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221 (2016).
  22. Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  23. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065 (2014).
  24. Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354 (2021).
  25. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
  26. Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871 (2022).
  27. Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222 (2019).
  28. Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749 (2020).
  29. Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333 (2013).
  30. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753 (2020).
  31. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111 (2021).
  32. Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
  33. Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119 (2022).

Play Video

Cite This Article
Otter, C. J., Fausto, A., Tan, L. H., Weiss, S. R., Cohen, N. A. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (199), e64868, doi:10.3791/64868 (2023).

View Video