В этом протоколе описаны ключевые этапы создания и характеристики 3D-органоидов полости рта и пищевода мышей, которые представляют собой нормальные, предопухолевые и плоскоклеточные поражения карциномы, вызванные химическим канцерогенезом.
Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) распространен во всем мире, на его долю приходится 90% всех случаев рака пищевода каждый год, и является самым смертоносным из всех плоскоклеточных карцином человека. Несмотря на недавний прогресс в определении молекулярных изменений, сопровождающих инициацию и развитие ESCC, прогноз пациента остается неблагоприятным. Функциональная аннотация этих молекулярных изменений является необходимым следующим шагом и требует моделей, которые охватывают молекулярные особенности ESCC и могут быть легко и недорого манипулированы для функциональной аннотации. У мышей, получавших миметический 4-нитрохинолиновый 1-оксид табачного дыма (4NQO), предсказуемо образуется ESCC и преднеоплазия пищевода. Следует отметить, что поражения 4NQO также возникают в полости рта, чаще всего на языке, а также в преджелудке, которые имеют многослойный плоский эпителий. Однако этими мышами нельзя просто манипулировать для проверки функциональных гипотез, поскольку создание изогенных моделей мышей требует много времени и ресурсов. Здесь мы преодолеваем это ограничение, генерируя трехмерные (3D) органоиды, полученные из отдельных клеток, у мышей, получавших 4NQO, чтобы охарактеризовать мышиные ESCC или предопухолевые клетки ex vivo. Эти органоиды улавливают характерные черты ESCC и преднеоплазии пищевода, могут быть дешево и быстро использованы для формирования изогенных моделей и могут быть использованы для экспериментов по сингенной трансплантации. Мы демонстрируем, как генерировать 3D-органоиды из нормальной, предопухолевой и SCC мышиной ткани пищевода, а также поддерживать и криоконсервировать эти органоиды. Применение этих универсальных органоидов широко и включает использование генетически модифицированных мышей и дальнейшую характеристику с помощью проточной цитометрии или иммуногистохимии, генерацию изогенных органоидных линий с использованием технологий CRISPR, а также скрининг лекарств или сингенную трансплантацию. Мы считаем, что широкое внедрение методов, продемонстрированных в этом протоколе, ускорит прогресс в этой области в борьбе с тяжелым бременем ESCC.
Плоскоклеточный рак пищевода (ESCC) является самым смертоносным из плоскоклеточных карцином человека из-за его поздней диагностики, резистентности к терапии и метастазирования 1,2. ESCC возникает из многослойного плоского эпителия, который выстилает просветную поверхность пищевода. Плоский эпителий состоит из пролиферативных базальных клеток и дифференцированных клеток в супрабазальном клеточном слое. В физиологических условиях базальные клетки экспрессируют такие маркеры, как p63, Sox2 и цитокератин K5 и K14, в то время как дифференцированные клетки экспрессируют K4, K13 и IVL. Базальные клетки сами по себе неоднородны и включают предполагаемые стволовые клетки, определяемые такими маркерами, как K153 и CD734. В гомеостазе базальные клетки подвергаются постмитотической терминальной дифференцировке в супрабазальном клеточном слое, тогда как дифференцированные клетки мигрируют и десквамируются в просвет для полного обновления эпителия. Напоминая о своих клетках происхождения, ESCC в разной степени демонстрирует плоскоклеточную дифференцировку. ESCC часто сопровождается мультифокальными гистологическими поражениями-предшественниками, известными как интраэпителиальная неоплазия (IEN) или дисплазия, включающие атипичные базалоидные клетки. В дополнение к эпителиальным изменениям, ESCC отображает ремоделирование тканей в субэпителиальном компартменте, где происходит активация ассоциированных с раком фибробластов (CAF) и рекрутирование иммунных / воспалительных клеток для содействия микроокружению, способствующему развитию опухоли.
Патогенез ESCC включает генетические изменения и воздействие факторов риска окружающей среды. Ключевые генетические поражения включают инактивацию генов-супрессоров опухолей TP53 и CDKN2A (p16INK4A) и активацию онкогенов CCND1 (циклин D1) и EGFR, которые приводят к нарушению функции контрольных точек клеточного цикла, аберрантной пролиферации и выживаемости в условиях генотоксического стресса, связанного с воздействием канцерогенов окружающей среды. Действительно, генетические изменения тесно взаимодействуют с поведенческими и экологическими факторами риска, чаще всего с употреблением табака и алкоголя. Табачный дым содержит канцерогены для человека, такие как ацетальдегид, который также является основным метаболитом алкоголя. Ацетальдегид индуцирует аддукты ДНК и межцепочечные сшивки ДНК, что приводит к повреждению ДНК и накоплению мутаций ДНК и хромосомной нестабильности. Учитывая чрезмерные митогенные стимулы и аберрантную пролиферацию от активации онкогенов, злокачественной трансформации эпителиальных клеток пищевода способствуют механизмы, позволяющие справляться с генотоксическим стрессом, включая активацию антиоксидантов, аутофагию и эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ). Интересно, что эти цитопротекторные функции часто активируются в раковых стволовых клетках ESCC (CSCs), которые характеризуются высокой экспрессией CD44 (CD44H) и обладают возможностями инициации опухоли, инвазии, метастазирования и резистентности к терапии 5,6,7.
ESCC был смоделирован в клеточной культуре и на моделях грызунов 8,9. За последние три десятилетия были разработаны надежные генно-инженерные мышиные модели ESCC. К ним относятся трансгенные мыши CCND1 и EGFR 10,11 и мыши с нокаутом p53 и p120Ctn 12,13. Тем не менее, единичные генетические изменения обычно не приводят к быстрому началу ESCC. Эта проблема была решена с помощью канцерогенов пищевода, которые хорошо повторяют генетические поражения человека в ESCC14. Например, 4-ниттрохинолин-1-оксид (4NQO) ускоряет развитие ESCC у трансгенных мышей CCND1 15. В последние годы предполагаемые эпителиальные стволовые клетки пищевода, клетки-предшественники и их соответствующие судьбы были исследованы на моделях мышейс прослеживаемой клеточной линией 3,4. Кроме того, эти мыши с прослеживаемой клеточной линией были использованы для изучения клеток происхождения ESCC и того, как такие клетки приводят к образованию CSC CD44H, с помощью обычной гистологии и молекулярной характеристики на основе омиксов7.
Одной из новых областей, связанных с этими моделями мышей, является новое применение методов культивирования клеток для анализа живых ESCC и клеток-предшественников в трехмерной (3D) органоидной системе, в которой архитектура исходных тканей повторяется ex vivo 7,8,9. Эти 3D-органоиды быстро выращиваются из одноклеточной суспензии, выделенной из тканей мышей, включая первичные и метастатические опухоли (например, поражения лимфатических узлов, легких и печени). Клетки встраиваются в экстракт базальной мембраны (BME) и питаются четко определенной средой для культивирования клеток, не содержащей сыворотки. 3D-органоиды растут в течение 7-10 дней, и полученные сферические структуры поддаются субкультуре, криоконсервации и анализам для анализа различных клеточных свойств и функций, включая маркеры CSC, EMT, аутофагию, пролиферацию, дифференцировку и апоптотическую гибель клеток.
Эти методы могут быть широко применены к 3D-органоидным культурам, полученным из любой многослойной плоской эпителиальной ткани, такой как слизистая оболочка головы и шеи (ротовая полость, язык, глотка и гортань) и даже преджелудка. Слизистая оболочка головы и шеи примыкает к пищеводу, и эти две ткани имеют сходную тканевую организацию, функцию и восприимчивость к заболеваниям. Плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC) и ESCC имеют общие генетические поражения и факторы риска окружающей среды, связанные с образом жизни, такие как воздействие табака и алкоголя. Подчеркивая это сходство, у мышей, получавших миметик табачного дыма 4NQO, легко развиваются как HNSCC, так и ESCC. Учитывая легкость, с которой описанные ниже протоколы могут быть применены к моделированию HNSCC, мы включаем конкретные инструкции по созданию 3D-органоидных культур из этих поражений.
Здесь мы приводим подробные протоколы для создания 3D-органоидов пищевода мышей (MEO), представляющих нормальные, предопухолевые и ESCC-поражения, которые развиваются у мышей, получавших 4NQO. Можно использовать различные штаммы мышей, в том числе распространенные лабораторные штаммы, такие как C57BL / 6, прослеживаемые по клеточному происхождению и другие генетически модифицированные производные. Мы подчеркиваем ключевые этапы, включая выделение нормального или больного эпителия пищевода мыши, приготовление одноклеточных суспензий, культивирование и мониторинг растущих 3D-органоидов, субкультуру, криоконсервацию и обработку для последующего анализа, включая морфологию и другие приложения.
Существует несколько важных шагов и соображений для создания и анализа MEO в описанных здесь протоколах. Для обеспечения воспроизводимости и строгости экспериментов MEO важны как биологические, так и технические реплики. Для биологических реплик обычно достаточно двух-трех независимых …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Общие ресурсы (проточная цитометрия, молекулярная патология, конфокальная и специализированная микроскопия) в Комплексном онкологическом центре им. Герберта Ирвинга при Колумбийском университете за техническую поддержку. Мы благодарим докторов Алана Дила, Адама Басса и Квок-Кин Вонга (NCI P01 «Механизмы канцерогенеза пищевода») и сотрудников лабораторий Рустги и Накагава за полезные обсуждения. Это исследование было поддержано следующими грантами NIH: P01CA098101 (H.N. и A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(Дж.Г.) R01CA266978 (К.Л.), R01DK132251 (К.Л.), R01DE031873 (К.Л.), P30DK132710 (К.М. и Х.Н.) и P30CA013696 (A.K.R.). Х.Н. и К.Л. являются лауреатами премии Колумбийского университета им. Герберта Ирвинга по комплексному онкологическому центру Multi-PI Pilot Award. Х.Н. является лауреатом премии Фонда исследований анемии Фанкони. F.M.H. является лауреатом премии Фонда Марка за исследования рака (20-60-51-MOME) и премии Американской ассоциации исследований рака. J.G. является лауреатом премии Американской гастроэнтерологической ассоциации (AGA).
0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
21 G needles | BD | 305167 | |
24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
Bacto agar | BD | 214010 | |
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
Forceps | VWR | 82027-386 | |
Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |