Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen voor het genereren en karakteriseren van muriene orale-oesofageale 3D-organoïden die normale, preneoplastische en plaveiselcelcarcinoomlaesies vertegenwoordigen die worden geïnduceerd via chemische carcinogenese.
Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) komt wereldwijd voor, goed voor 90% van alle gevallen van slokdarmkanker per jaar, en is het dodelijkste van alle menselijke plaveiselcelcarcinomen. Ondanks recente vooruitgang bij het definiëren van de moleculaire veranderingen die gepaard gaan met ESCC-initiatie en -ontwikkeling, blijft de prognose van de patiënt slecht. De functionele annotatie van deze moleculaire veranderingen is de noodzakelijke volgende stap en vereist modellen die zowel de moleculaire kenmerken van ESCC vastleggen als gemakkelijk en goedkoop kunnen worden gemanipuleerd voor functionele annotatie. Muizen behandeld met de tabaksrook mimetisch 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) vormen voorspelbaar ESCC en slokdarmpreneoplasie. Van belang is dat 4NQO-laesies ook voorkomen in de mondholte, meestal in de tong, evenals de voormaag, die allemaal het gestratificeerde plaveiselepitheel delen. Deze muizen kunnen echter niet eenvoudig worden gemanipuleerd voor het testen van functionele hypothesen, omdat het genereren van isogene muismodellen tijd- en middelenintensief is. Hierin overwinnen we deze beperking door eencellige driedimensionale (3D) organoïden te genereren van muizen die zijn behandeld met 4NQO om murine ESCC of preneoplastische cellen ex vivo te karakteriseren. Deze organoïden vangen de opvallende kenmerken van ESCC en slokdarmpreneoplasie, kunnen goedkoop en snel worden gebruikt om isogene modellen te vormen en kunnen worden gebruikt voor syngenetische transplantatie-experimenten. We demonstreren hoe 3D-organoïden te genereren uit normaal, preneoplastisch en SCC-muizenslokdarmweefsel en deze organoïden te onderhouden en te cryopreserveren. De toepassingen van deze veelzijdige organoïden zijn breed en omvatten het gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen en verdere karakterisering door flowcytometrie of immunohistochemie, het genereren van isogene organoïde lijnen met behulp van CRISPR-technologieën en medicijnscreening of syngenetische transplantatie. Wij zijn van mening dat de wijdverbreide toepassing van de in dit protocol gedemonstreerde technieken de vooruitgang op dit gebied ter bestrijding van de zware last van het ESCC zal versnellen.
Oesofageaal plaveiselcelcarcinoom (ESCC) is het dodelijkste van de menselijke plaveiselcelcarcinomen, vanwege de late diagnose, therapieresistentie en metastase 1,2. ESCC ontstaat uit het gelaagde plaveiselepitheel, dat het luminale oppervlak van de slokdarm bekleedt. Het plaveiselepitheel bestaat uit proliferatieve basale cellen en gedifferentieerde cellen binnen de suprabasale cellaag. Onder fysiologische omstandigheden drukken basale cellen markers uit zoals p63, Sox2 en cytokeratine K5 en K14, terwijl gedifferentieerde cellen K4, K13 en IVL tot expressie brengen. Basale cellen zelf zijn heterogeen en omvatten vermeende stamcellen gedefinieerd door markers zoals K153 en CD734. Bij homeostase ondergaan basale cellen post-mitotische terminale differentiatie binnen de suprabasale cellaag, terwijl gedifferentieerde cellen migreren en desquamateren in het lumen om epitheelvernieuwing te voltooien. ESCC doet denken aan hun cellen van oorsprong en vertoont plaveiselceldifferentiatie in verschillende mate. ESCC gaat vaak gepaard met multifocale histologische voorloperlaesies, bekend als intra-epitheliale neoplasie (IEN) of dysplasie, bestaande uit atypische basaloïde cellen. Naast epitheliale veranderingen vertoont ESCC weefselremodellering binnen het subepitheliale compartiment, waar de activering van kankergeassocieerde fibroblasten (CAF’s) en de rekrutering van immuun- / ontstekingscellen plaatsvinden om de tumorbevorderende micro-omgeving te bevorderen.
De pathogenese van ESCC omvat genetische veranderingen en blootstelling aan omgevingsrisicofactoren. Belangrijke genetische laesies omvatten de inactivatie van de tumorsuppressorgenen TP53 en CDKN2A (p16INK4A) en de activering van de CCND1 (cycline D1) en EGFR-oncogenen, die culmineren in een verminderde celcycluscontrolepuntfunctie, afwijkende proliferatie en overleving onder genotoxische stress gerelateerd aan blootstelling aan kankerverwekkende stoffen in het milieu. Inderdaad, genetische veranderingen werken nauw samen met gedrags- en omgevingsrisicofactoren, meestal tabaks- en alcoholgebruik. Tabaksrook bevat kankerverwekkende stoffen voor de mens, zoals aceetaldehyde, dat ook de belangrijkste metaboliet van alcohol is. Aceetaldehyde induceert DNA-adducten en interstreng DNA-crosslinks, wat leidt tot DNA-schade en de accumulatie van DNA-mutaties en chromosomale instabiliteit. Gezien overmatige mitogene stimuli en afwijkende proliferatie door oncogenactivering, wordt de kwaadaardige transformatie van slokdarmepitheelcellen vergemakkelijkt door mechanismen om genotoxische stress het hoofd te bieden, waaronder de activering van antioxidanten, autofagie en epitheliale-mesenchymale overgang (EMT). Interessant is dat deze cytoprotectieve functies vaak worden geactiveerd in ESCC-kankerstamcellen (CSC’s) die worden gekenmerkt door hoge CD44 (CD44H) expressie en de mogelijkheden hebben van tumorinitiatie, invasie, metastase en therapieresistentie 5,6,7.
ESCC is gemodelleerd in celkweek en in knaagdiermodellen 8,9. In de afgelopen drie decennia zijn robuuste genetisch gemanipuleerde muismodellen van ESCC ontwikkeld. Deze omvatten CCND1 en EGFR transgene muizen 10,11 en p53 en p120Ctn knock-out muizen 12,13. Enkelvoudige genetische veranderingen resulteren echter meestal niet in een snel optredende ESCC. Deze uitdaging is overwonnen met het gebruik van slokdarmcarcinogenen die de menselijke genetische laesies in ESCC14 goed samenvatten. Bijvoorbeeld, 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) versnelt ESCC ontwikkeling in CCND1 transgene muizen15. In de afgelopen jaren zijn vermeende slokdarmepitheelstamcellen, voorlopercellen en hun respectieve lotgevallen onderzocht in cellijn-traceerbare muismodellen 3,4. Bovendien zijn deze cellijn-traceerbare muizen gebruikt om de cellen van oorsprong van ESCC te onderzoeken en hoe dergelijke cellen aanleiding geven tot CD44H CSC’s via conventionele histologie en op omics gebaseerde moleculaire karakterisering7.
Een opkomend gebied gerelateerd aan deze muismodellen is de nieuwe toepassing van celkweektechnieken om levende ESCC- en voorlopercellen te analyseren in een driedimensionaal (3D) organoïde systeem waarin de architectuur van de oorspronkelijke weefsels ex vivo 7,8,9 wordt samengevat. Deze 3D-organoïden worden snel gekweekt uit een eencellige suspensie geïsoleerd uit muizenweefsels, waaronder primaire en gemetastaseerde tumoren (bijv. Lymfeklier-, long- en leverlaesies). De cellen zijn ingebed in keldermembraanextract (BME) en gevoed met een goed gedefinieerd serumvrij celkweekmedium. De 3D-organoïden groeien binnen 7-10 dagen en de resulterende bolvormige structuren zijn vatbaar voor subcultuur, cryopreservatie en testen voor het analyseren van een verscheidenheid aan cellulaire eigenschappen en functies, waaronder CSC-markers, EMT, autofagie, proliferatie, differentiatie en apoptotische celdood.
Deze methoden kunnen breed worden toegepast op 3D-organoïde culturen die zijn vastgesteld uit elk gestratificeerd plaveiselepitheelweefsel, zoals het hoofd- en nekslijmvlies (mondholte, tong, keelholte en strottenhoofd) en zelfs de voormaag. Het hoofd- en nekslijmvlies zijn aaneengesloten met de slokdarm en de twee weefsels delen een vergelijkbare weefselorganisatie, functie en vatbaarheid voor ziekten. Zowel hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) als ESCC delen genetische laesies en leefstijlgerelateerde omgevingsrisicofactoren zoals blootstelling aan tabak en alcohol. Om deze gelijkenis te onderstrepen, ontwikkelen muizen die zijn behandeld met de tabaksrook mimetische 4NQO gemakkelijk zowel HNSCC als ESCC. Gezien het gemak waarmee de hieronder beschreven protocollen kunnen worden toegepast op het modelleren van HNSCC, nemen we specifieke instructies op voor het vaststellen van 3D-organoïde culturen uit deze laesies.
Hierin bieden we gedetailleerde protocollen voor het genereren van murine oesofageale 3D-organoïden (MEO’s) die normale, preneoplastische en ESCC-laesies vertegenwoordigen die zich ontwikkelen bij muizen die zijn behandeld met 4NQO. Verschillende muizenstammen kunnen worden gebruikt, waaronder veel voorkomende laboratoriumstammen zoals C57BL / 6 en cellijn-traceerbare en andere genetisch gemanipuleerde derivaten. We benadrukken de belangrijkste stappen, waaronder de isolatie van normaal of ziek muizenoesofageaal epitheel, de bereiding van eencellige suspensies, de teelt en monitoring van de groeiende 3D-organoïden, subcultuur, cryopreservatie en de verwerking voor latere analyses, inclusief morfologie en andere toepassingen.
Er zijn verschillende kritieke stappen en overwegingen voor het genereren en analyseren van MEO’s in de hier beschreven protocollen. Om reproduceerbaarheid en striktheid in MEO-experimenten te garanderen, zijn biologische en technische replicaties beide belangrijk. Voor biologische replicaties zijn twee tot drie onafhankelijke muizen met ESCC over het algemeen voldoende per experimentele conditie. Het juiste aantal biologische replicaties kan echter variëren, afhankelijk van de parameters die in individuele onderzoeken …
The authors have nothing to disclose.
We danken de Shared Resources (Flow Cytometry, Molecular Pathology, and Confocal &Specialized Microscopy) van het Herbert Irving Comprehensive Cancer Center aan de Columbia University voor technische ondersteuning. We danken Drs. Alan Diehl, Adam J. Bass en Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanisms of Esophageal Carcinogenesis) en leden van de Rustgi en Nakagawa laboratoria voor nuttige discussies. Deze studie werd ondersteund door de volgende NIH-beurzen: P01CA098101 (H.N. en A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. en H.N.), en P30CA013696 (A.K.R.). H.N. en C.L. zijn ontvangers van de Columbia University Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award. H.N. is een ontvanger van de Fanconi Anemia Research Fund Award. F.M.H. is de ontvanger van de Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) en een American Association for Cancer Research Award. J.G. is de ontvanger van de American Gastroenterological Association (AGA) award.
0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
21 G needles | BD | 305167 | |
24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
Bacto agar | BD | 214010 | |
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
Forceps | VWR | 82027-386 | |
Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |