يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية لتوليد وتوصيف عضويات 3D عن طريق الفم والمريء التي تمثل آفات سرطان الخلايا الطبيعية والأورام والحرشفية الناجمة عن التسرطن الكيميائي.
ينتشر سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) في جميع أنحاء العالم ، حيث يمثل 90٪ من جميع حالات سرطان المريء كل عام ، وهو الأكثر فتكا من بين جميع سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية. على الرغم من التقدم الأخير في تحديد التغيرات الجزيئية المصاحبة لبدء ESCC وتطوره ، لا يزال تشخيص المريض ضعيفا. إن التعليق التوضيحي الوظيفي لهذه التغييرات الجزيئية هو الخطوة التالية الضرورية ويتطلب نماذج تلتقط السمات الجزيئية ل ESCC ويمكن معالجتها بسهولة وبتكلفة زهيدة للتعليق التوضيحي الوظيفي. الفئران المعالجة بمحاكاة دخان التبغ 4-نيتروكينولين 1-أكسيد (4NQO) تشكل بشكل متوقع ESCC والأورام المريئية. وتجدر الإشارة إلى أن آفات 4NQO تنشأ أيضا في تجويف الفم ، والأكثر شيوعا في اللسان ، وكذلك المعدة الأمامية ، والتي تشترك جميعها في ظهارة الحرشفية الطبقية. ومع ذلك ، لا يمكن التلاعب بهذه الفئران ببساطة لاختبار الفرضيات الوظيفية ، حيث أن توليد نماذج الفئران متساوية المنشأ يتطلب وقتا طويلا وموارد. هنا ، نتغلب على هذا القيد عن طريق توليد عضويات ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من خلية واحدة من الفئران المعالجة ب 4NQO لتوصيف الفئران ESCC أو الخلايا قبل الورمية خارج الجسم الحي. تلتقط هذه الكائنات العضوية السمات البارزة ل ESCC وأورام المريء ، ويمكن الاستفادة منها بثمن بخس وبسرعة لتشكيل نماذج متساوية المنشأ ، ويمكن استخدامها في تجارب زرع الجينات المتزامنة. نوضح كيفية توليد عضويات 3D من أنسجة المريء العادية ، preneoplastic ، و SCC الفئران والحفاظ على هذه المواد العضوية وحفظها بالتبريد. تطبيقات هذه الكائنات العضوية متعددة الاستخدامات واسعة وتشمل استخدام الفئران المعدلة وراثيا والمزيد من التوصيف عن طريق قياس التدفق الخلوي أو الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، وتوليد خطوط عضوية متساوية الجينات باستخدام تقنيات كريسبر ، وفحص الأدوية أو زرع الجينات. نعتقد أن الاعتماد الواسع النطاق للتقنيات الموضحة في هذا البروتوكول سيسرع التقدم في هذا المجال لمكافحة العبء الشديد ل ESCC.
سرطان الخلايا الحرشفية المريئي (ESCC) هو أكثر سرطانات الخلايا الحرشفية البشرية فتكا ، بسبب التشخيص المتأخر ومقاومة العلاج وورم خبيث 1,2. ينشأ ESCC من الظهارة الحرشفية الطبقية ، التي تبطن السطح اللمعي للمريء. تتكون الظهارة الحرشفية من خلايا قاعدية تكاثرية وخلايا متمايزة داخل طبقة الخلايا فوق القاعدية. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تعبر الخلايا القاعدية عن علامات مثل p63 و Sox2 و cytokeratin K5 و K14 ، بينما تعبر الخلايا المتمايزة عن K4 و K13 و IVL. الخلايا القاعدية نفسها غير متجانسة وتشمل الخلايا الجذعية المفترضة المحددة بعلامات مثل K153 و CD734. في الاتزان الداخلي، تخضع الخلايا القاعدية للتمايز الطرفي بعد الانقسام داخل طبقة الخلايا فوق القاعدية، في حين تهاجر الخلايا المتمايزة وتتقشر في التجويف لإكمال التجديد الطلائي. يذكرنا ESCC بخلاياهم الأصلية ، ويعرض تمايز الخلايا الحرشفية بدرجات متفاوتة. غالبا ما يصاحب ESCC آفات سلائف نسيجية متعددة البؤر ، تعرف باسم الأورام داخل الظهارة (IEN) أو خلل التنسج ، والتي تضم خلايا قاعدية غير نمطية. بالإضافة إلى التغيرات الظهارية ، يعرض ESCC إعادة تشكيل الأنسجة داخل المقصورة تحت الظهارية ، حيث يتم تنشيط الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) وتجنيد الخلايا المناعية / الالتهابية لتعزيز البيئة المكروية المعززة للورم.
ينطوي التسبب في ESCC على التغيرات الجينية والتعرض لعوامل الخطر البيئية. تشمل الآفات الجينية الرئيسية تعطيل الجينات المثبطة للورم TP53 و CDKN2A (p16INK4A) وتنشيط الجينات المسرطنة CCND1 (cyclin D1) و EGFR ، والتي تبلغ ذروتها في ضعف وظيفة نقطة تفتيش دورة الخلية ، والانتشار الشاذ ، والبقاء على قيد الحياة تحت الإجهاد السمي الجيني المرتبط بالتعرض للمواد المسرطنة البيئية. في الواقع ، تتفاعل التغيرات الجينية بشكل وثيق مع عوامل الخطر السلوكية والبيئية ، وأكثرها شيوعا تعاطي التبغ والكحول. يحتوي دخان التبغ على مواد مسرطنة بشرية مثل الأسيتالديهيد ، وهو أيضا المستقلب الرئيسي للكحول. يحفز الأسيتالديهيد تقريب الحمض النووي والروابط المتقاطعة للحمض النووي ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي وتراكم طفرات الحمض النووي وعدم استقرار الكروموسومات. بالنظر إلى المحفزات الانقسامية المفرطة والانتشار الشاذ من تنشيط الجينات المسرطنة ، يتم تسهيل التحول الخبيث للخلايا الظهارية المريئية من خلال آليات للتعامل مع الإجهاد السمي الجيني ، بما في ذلك تنشيط مضادات الأكسدة ، والالتهام الذاتي ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT). ومن المثير للاهتمام ، أن وظائف الحماية الخلوية هذه غالبا ما يتم تنشيطها في الخلايا الجذعية السرطانية ESCC (CSCs) التي تتميز بتعبير CD44 (CD44H) العالي ولديها قدرات بدء الورم ، والغزو ، ورم خبيث ، ومقاومة العلاج5،6،7.
تم تصميم ESCC في زراعة الخلايا وفي نماذجالقوارض 8,9. في العقود الثلاثة الماضية ، تم تطوير نماذج فئران قوية معدلة وراثيا من ESCC. وتشمل هذه الفئران المعدلة وراثيا CCND1 و EGFR 10،11 و p53 و p120Ctn بالضربة القاضية12,13. ومع ذلك ، فإن التغيرات الجينية الفردية لا تؤدي عادة إلى ظهور ESCC سريع. تم التغلب على هذا التحدي باستخدام المواد المسرطنة المريئية التي تلخص بشكل جيد الآفات الوراثية البشرية في ESCC14. على سبيل المثال ، يسرع 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) تطوير ESCC في الفئران المعدلة وراثيا CCND1 15. في السنوات الأخيرة ، تم التحقيق في الخلايا الجذعية الظهارية المريئية المفترضة ، والخلايا السلفية ، ومصائر كل منها في نماذج الفئران التي يمكن تتبعها من سلالة الخلايا 3,4. علاوة على ذلك ، تم استخدام هذه الفئران التي يمكن تتبعها لاستكشاف خلايا منشأ ESCC وكيف تؤدي هذه الخلايا إلى ظهور CSCs CD44H عبر علم الأنسجة التقليدي والتوصيف الجزيئي القائم على omics7.
أحد المجالات الناشئة المتعلقة بنماذج الفئران هذه هو التطبيق الجديد لتقنيات زراعة الخلايا لتحليل ESCC الحية والخلايا السليفة في نظام عضوي ثلاثي الأبعاد (3D) يتم فيه تلخيص بنية الأنسجة الأصلية خارج الجسم الحي7،8،9. ونمت هذه المواد العضوية 3D بسرعة من تعليق خلية واحدة معزولة من أنسجة الفئران ، بما في ذلك الأورام الأولية والنقيلي (على سبيل المثال ، العقدة الليمفاوية والرئة وآفات الكبد). يتم تضمين الخلايا في مستخلص الغشاء القاعدي (BME) وتغذيتها بوسط زراعة خلايا خال من المصل محدد جيدا. تنمو الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد في غضون 7-10 أيام ، وتكون الهياكل الكروية الناتجة قابلة للزراعة الفرعية ، والحفظ بالتبريد ، والمقايسات لتحليل مجموعة متنوعة من الخصائص والوظائف الخلوية ، بما في ذلك علامات CSC ، EMT ، الالتهام الذاتي ، الانتشار ، التمايز ، وموت الخلايا المبرمج.
يمكن تطبيق هذه الطرق على نطاق واسع على الثقافات العضوية 3D التي أنشئت من أي الأنسجة الظهارية الحرشفية الطبقية ، مثل الغشاء المخاطي للرأس والرقبة (تجويف الفم واللسان والبلعوم والحنجرة) وحتى المعدة الأمامية. الغشاء المخاطي للرأس والرقبة متجاوران مع المريء ، ويشترك النسيجان في تنظيم الأنسجة ووظيفتها وقابليتها للإصابة بالأمراض. يشترك كل من سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) و ESCC في الآفات الوراثية وعوامل الخطر البيئية المرتبطة بنمط الحياة مثل التعرض للتبغ والكحول. وتأكيدا على هذا التشابه ، فإن الفئران المعالجة بمحاكاة دخان التبغ 4NQO تطور بسهولة كلا من HNSCC و ESCC. نظرا للسهولة التي يمكن بها تطبيق البروتوكولات الموضحة أدناه على نمذجة HNSCC ، فإننا ندرج تعليمات محددة لإنشاء ثقافات عضوية 3D من هذه الآفات.
هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد عضويات 3D مريئية للفئران (MEOs) تمثل الآفات الطبيعية والأورام و ESCC التي تتطور في الفئران المعالجة ب 4NQO. يمكن استخدام سلالات الفئران المختلفة ، بما في ذلك السلالات المختبرية الشائعة مثل C57BL / 6 ومشتقات سلالة الخلايا التي يمكن تتبعها وغيرها من المشتقات المعدلة وراثيا. نؤكد على الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك عزل ظهارة المريء الفئرانية الطبيعية أو المريضة ، وإعداد معلقات أحادية الخلية ، وزراعة ومراقبة المواد العضوية 3D المتنامية ، والثقافة الفرعية ، والحفظ بالتبريد ، ومعالجة التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك التشكل والتطبيقات الأخرى.
هناك العديد من الخطوات والاعتبارات الحاسمة لتوليد وتحليل MEOs في البروتوكولات الموضحة هنا. لضمان قابلية التكرار والدقة في تجارب MEO ، تعد النسخ المتماثلة البيولوجية والتقنية مهمة. بالنسبة للتكرارات البيولوجية ، فإن اثنين إلى ثلاثة فئران مستقلة تحمل ESCC كافية بشكل عام لكل حالة تجريبية. ومع ذل…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الموارد المشتركة (قياس التدفق الخلوي ، وعلم الأمراض الجزيئي ، والفحص المجهري البؤري والمتخصص) في مركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان في جامعة كولومبيا على الدعم الفني. نشكر الدكاترة آلان ديهل وآدم جيه باس وكوك كين وونغ (آليات NCI P01 لسرطان المريء) وأعضاء مختبرات روستي وناكاجاوا على المناقشات المفيدة. تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة التالية: P01CA098101 (H.N. و A.K.R.) ، R01DK114436 (H.N.) ، R01AA026297 (H.N.) ، L30CA264714 (SF) ، DE031112-01 (F.M.H.) ، KL2TR001874 (F.M.H.) ، 3R01CA255298-01S1 (JG) ، 2L30DK126621-02
(ج.ج.) R01CA266978 (C.L.) و R01DK132251 (C.L.) و R01DE031873 (C.L.) و P30DK132710 (CM و H.N.) و P30CA013696 (A.K.R.). حصل H.N. و C.L. على جائزة مركز هربرت إيرفينغ الشامل للسرطان Multi-PI Pilot من جامعة كولومبيا. حصل H.N. على جائزة صندوق فانكوني لأبحاث فقر الدم. حصل F.M.H. على جائزة مؤسسة مارك لأبحاث السرطان (20-60-51-MOME) وجائزة الجمعية الأمريكية لأبحاث السرطان. حصل JG على جائزة الجمعية الأمريكية لأمراض الجهاز الهضمي (AGA).
0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
21 G needles | BD | 305167 | |
24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
Bacto agar | BD | 214010 | |
CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
Forceps | VWR | 82027-386 | |
Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |