Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.
Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.
Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год1. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, которые можно было бы постоянно культивировать; Однако было показано, что недавняя модель полезна для фармакологического тестирования терапевтических агентов и иммунотерапии2. Таким образом, мы адаптировали органотипическую систему культивирования срезов, которая использовалась при других типах рака человека, таких как рак головного мозга, молочной железы, поджелудочной железы, легких, яичников и других 3,4,5,6.
В дополнение к аппендикулярным новообразованиям, ПМП иногда возникает при других типах опухолей, включая рак яичников7, а в редких случаях – внутрипротоковые папиллярные муцинозные новообразования8 и рак толстой кишки9. Кроме того, эти опухоли, как правило, растут медленно, с низкими показателями приживления в моделях ксенотрансплантата пациента (PDX)10,11. Учитывая эти проблемы, существует неудовлетворенная потребность в разработке моделей для изучения этого заболевания, чтобы начать понимать патобиологию PMP и то, как эти раковые клетки: рекрутируются на поверхности брюшины, размножаются и избегают иммунного надзора.
Несмотря на то, что опухолевые срезы вырезаны из системного сосудистого кровообращения, они содержат клеточные и бесклеточные компоненты, включая внеклеточный матрикс, стромальные клетки, иммунные клетки, раковые клетки, эндотелиальные клетки и нервы. Это полуинтактное микроокружение позволяет проводить функциональное исследование этих типов клеток, что является уникальным преимуществом по сравнению с 3D-органоидными культурами, которые состоят только из раковых клеток12. Хотя органотипические культуры срезов в некоторых отношениях являются преимуществами, они также по своей сути являются подходом, основанным на низкой пропускной способности, по сравнению с 3D-органоидами, которые могут быть расширены, и подходят для мультиплексного скрининга исследуемых терапевтических препаратов13,14,15. В случае ПМП не было никаких отчетов, документально подтверждающих надежное укоренение и постоянное прохождение органоидов, полученных из ПМП16. Вероятно, это связано с медленно растущей природой опухолевых клеток, полученных из PMP, а также с низким количеством злокачественных эпителиальных клеток, обнаруженных в этих муцинозных опухолях. Учитывая необходимость разработки моделей для изучения ПМП, органотипические срезы уникально подходят для изучения этого заболевания. Мы представляем протокол подготовки, визуализации и анализа PMP из образцов человека.
В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу …
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Керси Пестонджамасп из центра визуализации Онкологического центра Мура за помощь с микроскопами UCSD Специализированный центр поддержки рака P30 грант 2P30CA023100. Эта работа была дополнительно поддержана грантом на публикацию JoVE (JRW), а также щедрыми подарками от поместья Элизабет и Эд Кримерс, Фонда семьи Юске, Фонда исследований рака желудочно-кишечного тракта и Фонда исследований метастазов в брюшной полости (AML).
1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
ATPγS | Tocris | 4080 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
CD11b | Biolegend | 101228 | |
CD206 | Biolegend | 321140 | |
CD3 | Biolegend | 555333 | |
CD4 | Biolegend | 357410 | |
CD45 | Biolegend | 304006 | |
CD8 | Biolegend | 344721 | |
CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |