We beschrijven een protocol voor de productie, cultuur en visualisatie van menselijke kankers, die zijn uitgezaaid naar de peritoneale oppervlakken. Reseceerde tumormonsters worden gesneden met behulp van een vibratoom en gekweekt op permeabele inserts voor verhoogde oxygenatie en levensvatbaarheid, gevolgd door beeldvorming en downstream-analyses met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzame aandoening die het gevolg is van de verspreiding van een mucineuze primaire tumor en de resulterende accumulatie van mucine-afscheidende tumorcellen in de peritoneale holte. PMP kan voortkomen uit verschillende soorten kanker, waaronder appendiceale, eierstok- en colorectale, hoewel appendiceale neoplasmata veruit de meest voorkomende etiologie zijn. PMP is een uitdaging om te bestuderen vanwege de (1) zeldzaamheid, (2) beperkte muizenmodellen en (3) mucineuze, acellulaire histologie. De hier gepresenteerde methode maakt real-time visualisatie en ondervraging van deze tumortypen mogelijk met behulp van patiënt-afgeleide ex vivo organotypische plakjes in een preparaat waarbij de tumormicro-omgeving (TME) intact blijft. In dit protocol beschrijven we eerst de bereiding van tumorplakken met behulp van een vibratoom en vervolgens een langetermijncultuur. Ten tweede beschrijven we confocale beeldvorming van tumorplakken en hoe functionele uitlezingen van levensvatbaarheid, calciumbeeldvorming en lokale proliferatie kunnen worden gevolgd. Kortom, plakjes worden geladen met beeldvormende kleurstoffen en worden in een beeldvormingskamer geplaatst die op een confocale microscoop kan worden gemonteerd. Time-lapse-video’s en confocale afbeeldingen worden gebruikt om de initiële levensvatbaarheid en cellulaire functionaliteit te beoordelen. Deze procedure onderzoekt ook translationele cellulaire beweging en paracriene signaleringsinteracties in de TME. Ten slotte beschrijven we een dissociatieprotocol voor tumorplakken dat moet worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse. Kwantitatieve flowcytometrie-analyse kan worden gebruikt voor bench-to-bedside therapeutische testen om veranderingen te bepalen die optreden in het immuunlandschap en de epitheelcelinhoud.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) is een zeldzaam syndroom met een incidentie van 1 per miljoen mensen per jaar1. De meeste PMP-gevallen worden veroorzaakt door metastasen van appendiceale neoplasmata. Aangezien muizen geen mensachtige appendix hebben, blijft het modelleren van dit type kanker uiterst uitdagend. Hoewel de primaire ziekte vaak te genezen is door chirurgische resectie, zijn de behandelingsopties voor gemetastaseerde ziekte beperkt. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van dit nieuwe organotypische slice-model het bestuderen van de pathobiologie van PMP. Tot op heden zijn er geen appendiceale organoïde modellen die eeuwigdurend kunnen worden gekweekt; Een recent model bleek echter nuttig te zijn voor het farmacologisch testen van therapeutische middelen en immunotherapie2. Als zodanig hebben we een organotypisch plakkweeksysteem aangepast, dat is gebruikt bij andere soorten menselijke kankers, zoals hersenen, borsten, pancreas, longen, eierstokken en anderen 3,4,5,6.
Naast appendiceale neoplasmata is PMP af en toe het gevolg van andere tumortypen, waaronder eierstokkanker7, en in zeldzame omstandigheden intraductale papillaire mucineuze neoplasmata8 en darmkanker9. Bovendien hebben deze tumoren de neiging om langzaam te groeien, met slechte enentpercentages in patiënt-afgeleide xenograft (PDX) -modellen10,11. Gezien deze uitdagingen is er een onvervulde behoefte om modellen te ontwikkelen om deze ziekte te bestuderen om de pathobiologie van PMP te begrijpen, en hoe deze kankercellen: worden gerekruteerd naar de peritoneale oppervlakken, prolifereren en ontsnappen aan immuunsurveillance.
Hoewel gesneden uit de systemische vasculaire circulatie, bevatten tumorplakken cellulaire en acellulaire componenten, waaronder de extracellulaire matrix, stromale cellen, immuuncellen, kankercellen, endotheelcellen en zenuwen. Deze semi-intacte micro-omgeving maakt het functioneel onderzoek van deze celtypen mogelijk, wat uniek voordelig is in vergelijking met 3D-organoïde culturen, die alleen uit kankercellen bestaan12. Hoewel organotypische plakculturen in sommige opzichten voordelig zijn, zijn ze ook inherent een op lage doorvoer gebaseerde benadering, vergeleken met 3D-organoïden, die kunnen worden uitgebreid en geschikt zijn voor multiplexed experimentele therapeutische geneesmiddelenscreening13,14,15. In het geval van PMP zijn er geen rapporten die een betrouwbare vaststelling en eeuwigdurende doorgifte van PMP-afgeleide organoïden documenteren16. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de langzaam groeiende aard van PMP-afgeleide tumorcellen, evenals het lage aantal kwaadaardige epitheelcellen in deze mucineuze tumoren. Gezien de noodzaak om modellen te ontwikkelen om PMP te bestuderen, zijn organotypische plakjes bij uitstek geschikt om deze ziekte te bestuderen. We presenteren een protocol voor het voorbereiden, in beeld brengen en analyseren van PMP van menselijke exemplaren.
Dit manuscript beschrijft een techniek die kan worden gebruikt om menselijke pseudomyxoma peritonei (PMP) tumormonsters te kweken, te ondervragen en te analyseren. We hebben talloze downstream functionele assays gebruikt om de tumorimmuunmicro-omgeving te ondervragen en een platform voor bench-to-bedside testen.
Hoewel de methode zeer efficiënt is in onze handen, vereist het enige oefening om tumormonsters te snijden met behulp van een vibratoom. We kwamen namelijk problemen tegen die te wijt…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Kersi Pestonjamasp van de Moores Cancer Center imaging core facility bedanken voor hulp bij de microscopen UCSD Specialized Cancer Support Center P30 grant 2P30CA023100. Dit werk werd bovendien ondersteund door een JoVE-publicatiebeurs (JRW), evenals gulle giften uit de nalatenschap van Elisabeth en Ad Creemers, de Euske Family Foundation, het Gastrointestinal Cancer Research Fund en het Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
ATPγS | Tocris | 4080 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
CD11b | Biolegend | 101228 | |
CD206 | Biolegend | 321140 | |
CD3 | Biolegend | 555333 | |
CD4 | Biolegend | 357410 | |
CD45 | Biolegend | 304006 | |
CD8 | Biolegend | 344721 | |
CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |