Este artículo describe un nuevo modelo de ratón para la transición del neumococo de un colonizador asintomático a un patógeno causante de enfermedades durante la infección viral. Este modelo se puede adaptar fácilmente para estudiar las interacciones polimicrobianas y huésped-patógeno durante las diferentes fases de la progresión de la enfermedad y entre varios huéspedes.
Streptococcus pneumoniae (neumococo) es un colonizador asintomático de la nasofaringe en la mayoría de los individuos, pero puede progresar a un patógeno pulmonar y sistémico tras la infección por el virus de la influenza A (IAV). La edad avanzada aumenta la susceptibilidad del huésped a la neumonía neumocócica secundaria y se asocia con peores resultados de la enfermedad. Los factores del huésped que impulsan esos procesos no están bien definidos, en parte debido a la falta de modelos animales que reproduzcan la transición de la colonización asintomática a la enfermedad clínica grave.
Este artículo describe un nuevo modelo de ratón que recrea la transición de los neumococos de transporte asintomático a enfermedad tras una infección viral. En este modelo, los ratones se inoculan primero intranasalmente con neumococos cultivados en biopelícula para establecer un transporte asintomático, seguido de una infección por IAV tanto de la nasofaringe como de los pulmones. Esto resulta en diseminación bacteriana a los pulmones, inflamación pulmonar y signos obvios de enfermedad que pueden progresar a letalidad. El grado de enfermedad depende de la cepa bacteriana y los factores del huésped.
Es importante destacar que este modelo reproduce la susceptibilidad del envejecimiento, porque en comparación con los ratones jóvenes, los ratones viejos muestran una enfermedad clínica más grave y sucumben a la enfermedad con mayor frecuencia. Al separar el transporte y la enfermedad en distintos pasos y brindar la oportunidad de analizar las variantes genéticas tanto del patógeno como del huésped, este modelo de coinfección por S. pneumoniae / IAV permite el examen detallado de las interacciones de un patobiológico importante con el huésped en diferentes fases de progresión de la enfermedad. Este modelo también puede servir como una herramienta importante para identificar posibles objetivos terapéuticos contra la neumonía neumocócica secundaria en huéspedes susceptibles.
Streptococcus pneumoniae (neumococo) son bacterias Gram-positivas que residen asintomáticamente en la nasofaringe de la mayoría de los individuos sanos 1,2. Promovido por factores que no están completamente definidos, los neumococos pueden pasar de colonizadores benignos de la nasofaringe a patógenos que se diseminan a otros órganos, lo que resulta en infecciones graves, como otitis media, neumonía y bacteriemia3. La presentación de la enfermedad neumocócica depende, en parte, de las diferencias específicas de la cepa, incluido el serotipo, que se basa en la composición de los polisacáridos capsulares. Ha habido más de 100 serotipos caracterizados hasta ahora, y algunos están asociados con infecciones más invasivas 4,5. Varios otros factores aumentan el riesgo de enfermedad neumocócica. Uno de estos factores es la infección viral, donde el riesgo de neumonía neumocócica aumenta 100 veces por IAV 6,7. Históricamente, S. pneumoniae es una de las causas más comunes de neumonía bacteriana secundaria después de la influenza y se asocia con peores resultados8. Otro factor de riesgo importante es la edad avanzada. De hecho, S. pneumoniae es la principal causa de neumonía bacteriana adquirida en la comunidad en ancianos mayores de 65 años 9,10. Los ancianos representan la mayoría (>75%) de las muertes por neumonía e influenza, lo que indica que los dos factores de riesgo, el envejecimiento y la infección por IAV, empeoran sinérgicamente la susceptibilidad a la enfermedad11,12,13,14. Sin embargo, los mecanismos por los cuales la infección viral provoca la transición de neumococos de colonizador asintomático a patógeno invasivo y cómo esto es moldeado por los factores del huésped siguen estando mal definidos. Esto se debe en gran parte a la ausencia de un modelo animal pequeño que recapitule la transición de la colonización neumocócica asintomática a la enfermedad clínica crítica.
Los estudios de coinfección se han modelado clásicamente en ratones inoculados con neumococos directamente en los pulmones 7 días después de la infección por influenza15,16. Esto reproduce la susceptibilidad a la neumonía bacteriana secundaria y es ideal para estudiar cómo las respuestas inmunes antivirales perjudican las defensas antibacterianas17. Sin embargo, estudios longitudinales en humanos han demostrado que el transporte neumocócico en la nasofaringe, donde las bacterias pueden formar biofilms asintomáticos18, está uniformemente asociado con enfermedades invasivas 19,20. Los aislados bacterianos de infecciones del oído medio, pulmón y sangre son genéticamente idénticos a los que se encuentran en la nasofaringe20. Así, para estudiar la transición del transporte asintomático a la enfermedad invasiva después de la infección por IAV, se estableció un modelo en el que a los ratones se les administraron neumococos cultivados con biopelícula por vía intranasal seguidos de infección por IAV de la nasofaringe21,22. La infección viral de la vía aérea superior condujo a cambios en el ambiente del huésped que llevaron a la dispersión de neumococos de las biopelículas y su propagación a las vías aéreas inferiores21. Estas bacterias dispersas tenían una expresión regulada al alza de factores de virulencia importantes para la infección, convirtiéndolas de colonizadoras a patógenos21. Estas observaciones resaltan la compleja interacción entre el virus, el huésped y las bacterias y demuestran que los cambios en el huésped desencadenados por la infección viral tienen un impacto directo en el comportamiento neumocócico, que, a su vez, altera el curso de la infección bacteriana. Sin embargo, este modelo no logra recapitular los signos graves de enfermedad observados en humanos, probablemente porque el virus se limita a la cavidad nasal, y los efectos sistémicos de la infección viral sobre la inmunidad del huésped y el daño pulmonar no se recapitulan.
Recientemente establecimos un modelo que incorpora la compleja interacción entre el huésped y los patógenos, pero también imita más de cerca la gravedad de la enfermedad observada en humanos23. En este modelo, los ratones se infectan primero por vía intranasal con neumococos cultivados en biopelícula para establecer un transporte asintomático, seguido de la infección por IAV tanto de la nasofaringe como de los pulmones. Esto resultó en diseminación bacteriana a los pulmones, inflamación pulmonar y enfermedad que progresó a letalidad en una fracción de ratones jóvenes23. Este estudio previo demostró que tanto la infección viral como la bacteriana alteraron la defensa del huésped: la infección viral promovió la diseminación bacteriana, y la colonización bacteriana previa afectó la capacidad del huésped para controlar los niveles pulmonares de IAV23. El examen de la respuesta inmune reveló que la infección por IAV disminuyó la actividad antibacteriana de los neutrófilos, mientras que la colonización bacteriana embotó la respuesta de interferón tipo I crítica para la defensa antiviral23. Es importante destacar que este modelo reprodujo la susceptibilidad del envejecimiento. En comparación con los ratones jóvenes, los ratones viejos mostraron signos de enfermedad antes, mostraron una enfermedad clínica más grave y sucumbieron a la infección con mayor frecuencia23. El trabajo presentado en este manuscrito muestra que el grado de enfermedad también depende de la cepa bacteriana, porque las cepas neumocócicas invasivas muestran una diseminación más eficiente sobre la infección por IAV, muestran signos más evidentes de inflamación pulmonar y dan como resultado tasas aceleradas de enfermedad en comparación con las cepas no invasivas. Por lo tanto, este modelo de coinfección por S. pneumoniae / IAV permite el examen detallado de los factores patógenos y del huésped y es adecuado para estudiar las respuestas inmunes a las infecciones polimicrobianas en las diferentes fases de la progresión de la enfermedad.
La mayoría de los estudios experimentales de coinfección por S. pneumoniae / IAV existentes se basan en la administración bacteriana en los pulmones de ratones preinfectados con IAV. Estos modelos han ayudado a identificar cambios en el ambiente pulmonar y la respuesta inmune sistémica que hacen que el huésped sea susceptible a la infección bacteriana secundaria 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Sin embargo, estos modelos no han logrado imitar la transición de S. pneumoniae de un colonizador asintomático a un patógeno capaz de causar infecciones pulmonares y sistémicas graves. Además, estos modelos no son adecuados para estudiar los factores del huésped y las interacciones huésped-patógeno en el tracto respiratorio superior que contribuyen a la susceptibilidad a la infección. Un modelo previo para el movimiento de neumococos de la nasofaringe al pulmón después de la infección por IAV se basó en la infección bacteriana de la nasofaringe seguida de una infección viral. Sin embargo, no logró reproducir los signos graves de enfermedad observados en pacientes humanos21. El modelo modificado de infección murina descrito aquí recapitula la transición de S. pneumoniae de portador asintomático a un patógeno que causa enfermedad clínica grave.
Un paso crítico de este modelo es establecer la infección por S. pneumoniae en la nasofaringe. Streptococcus pneumoniae forma biofilms y coloniza la nasofaringe con diferentes eficiencias21,38. Para establecer una infección consistente, se requieren al menos 5 × 106 UFC de las cepas bacterianas cultivadas en biopelícula probadas hasta ahora23. Se recomienda que cualquier nueva cepa bacteriana sea probada para una infección estable de la nasofaringe antes de la infección viral. Para la coinfección viral, estudios previos han encontrado que la infección intranasal con IAV es necesaria para la dispersión de las bacterias de la nasofaringe21,22,23. En esos estudios previos, se utilizaron 500 PFU de IAV para la administración intranasal, mientras que en este estudio, 200 PFU fueron suficientes para aumentar el número de bacterias en la nasofaringe. La infección por IAV no se limita a las vías aéreas superiores y puede extenderse a los pulmones39,40, lo que es clave para hacer que el ambiente pulmonar sea más permisivo para la infección bacteriana15,16,41. La administración de IAV a los pulmones se puede lograr mediante administración intranasal o instalación intratraqueal de ratones anestesiados. Trabajos previos con ratones BALB/cByJ encontraron que la administración intranasal resulta en neumonía viral21; sin embargo, el acceso del inóculo a los pulmones después de la inoculación intranasal está más restringido en ratones C57BL/6. En ratones C57BL/6, se requiere una instalación intratraqueal para la administración consistente del virus23. En este modelo, la colonización bacteriana previa acelera la presentación de los síntomas de la enfermedad después de la infección viral23. Como la infección viral puede causar síntomas de enfermedad con una posible variación en la cinética, se recomienda probar primero un rango de dosis para cualquier nueva cepa viral probada y elegir una dosis que revele una cinética acelerada en huéspedes coinfectados.
Los pulmones proporcionan otra lectura crítica para la evaluación de la enfermedad en este modelo. Para la evaluación de la carga de patógenos y la afluencia de células inmunes, se puede utilizar un pulmón del mismo ratón. Sin embargo, como la gravedad de la infección y la inflamación pueden diferir entre los lóbulos, se recomienda no tomar diferentes lóbulos del mismo pulmón para las diversas evaluaciones. Más bien, todos los lóbulos se pueden picar en trozos pequeños, mezclarse bien y luego analizarse por igual para las diferentes evaluaciones. Del mismo modo, la nasofaringe se puede utilizar para la enumeración de UFC bacteriana o PFU viral y respuesta inmune. Sin embargo, el número de células obtenidas de los lavados y el tejido es demasiado bajo para realizar la citometría de flujo sin agrupar las muestras de ratones dentro del mismo grupo. Alternativamente, la inflamación en la nasofaringe puede ser evaluada histológicamente23.
Una característica crítica de este modelo es que recapitula la enfermedad clínica observada en los pacientes. En humanos, la neumonía neumocócica secundaria después de la infección por IAV a menudo resulta en signos obvios de enfermedad, incluyendo tos, disnea, fiebre y dolores musculares que pueden conducir a hospitalizaciones, insuficiencia respiratoria e incluso la muerte 8,15,42,43. Este modelo recapitula los signos graves de enfermedad clínica observados en humanos en términos de dificultad para respirar (reflejada en la puntuación respiratoria) y malestar general (reflejado en las puntuaciones de postura y movimiento) mostrados por los ratones, así como la muerte en algunos de los controles jóvenes sanos. Los síntomas exacerbados de la enfermedad en ratones coinfectados son probablemente el resultado tanto de la diseminación bacteriana a los pulmones como de la alteración de la depuración viral en ratones con porte neumocócico23. Una limitación del modelo es que la incidencia de enfermedad clínica y diseminación bacteriana de la nasofaringe varía entre ratones y está influenciada por la cepa bacteriana, la edad del huésped y el genotipo21,22,23. Reflejando esto, para cepas invasivas, la progresión de la infección localizada (sin bacteriemia detectable) a la muerte puede ocurrir dentro de las 24 h. Por lo tanto, para una verdadera evaluación de la propagación sistémica, la bacteriemia debe seguirse durante intervalos más cortos (cada 6-12 h). Del mismo modo, la puntuación de la enfermedad puede cambiar rápidamente, particularmente en las primeras 72 h después de la coinfección. Por lo tanto, para seguir de cerca los síntomas de la enfermedad, es aconsejable controlar a los ratones tres veces al día durante los días 1-3 posteriores a la infección por IAV.
En resumen, este modelo replica el movimiento de S. pneumoniae de un colonizador asintomático de la nasofaringe a un patógeno capaz de causar enfermedad pulmonar y sistémica tras la infección por IAV. En este modelo, el IAV desencadena la transición de S. pneumoniae a través de la modificación del comportamiento bacteriano en la nasofaringe, aumentando la diseminación bacteriana al pulmón y alterando la inmunidad antibacteriana23. Del mismo modo, el transporte bacteriano embota las respuestas inmunes antivirales y perjudica la eliminación del IAV de los pulmones23. Esto hace que este modelo sea ideal para analizar los cambios en las respuestas inmunes en infecciones únicas versus polimicrobianas. Además, el curso de la enfermedad después de la coinfección depende, en parte, de la cepa de neumococos presentes en la nasofaringe. Por lo tanto, el modelo es adecuado para diseccionar los factores bacterianos necesarios para la colonización asintomática versus la transición patógena de S. pneumoniae. Por último, este modelo reproduce la susceptibilidad del envejecimiento a las coinfecciones, y aunque esto no se probó aquí, se puede utilizar fácilmente para evaluar el impacto de los antecedentes del huésped en el curso de la enfermedad. En conclusión, separar el transporte y la enfermedad en distintos pasos brinda la oportunidad de analizar las variantes genéticas tanto de los patógenos como del huésped, lo que permite el examen detallado de las interacciones de un patobiológico importante con el huésped en diferentes fases de la progresión de la enfermedad. En el futuro, este modelo se puede utilizar para adaptar las opciones de tratamiento para los huéspedes vulnerables.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a Nick Lenhard por la lectura crítica y edición de este manuscrito. También nos gustaría agradecer a Andrew Camilli y Anthony Campagnari por las cepas bacterianas y a Bruce Davidson por las cepas virales. Este trabajo fue apoyado por la Subvención del Instituto Nacional de Salud (R21AG071268-01) a J.L. y las Subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) a E.N.B.G.
4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
BD Fortessa | Flow cytometer | ||
BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
MilQ water | Ultra-pure water | ||
Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |