本文描述了一种新的小鼠模型,用于肺炎球菌在病毒感染期间从无症状定植者转变为致病病原体。该模型可以很容易地适应研究疾病进展不同阶段和各种宿主之间的多种微生物和宿主 – 病原体相互作用。
肺炎链球菌(肺炎球菌)是大多数人鼻咽的无症状定植者,但在感染甲型流感病毒 (IAV) 后可进展为肺部和全身病原体。高龄会增加宿主对继发性肺炎球菌肺炎的易感性,并与疾病结局恶化有关。驱动这些过程的宿主因素尚未明确,部分原因是缺乏重现从无症状定植到严重临床疾病的转变的动物模型。
本文描述了一种新的小鼠模型,该模型重现了肺炎球菌在病毒感染后从无症状携带到疾病的转变。在该模型中,首先用生物膜生长的肺炎球菌鼻内接种小鼠以建立无症状携带,然后鼻咽和肺部的IAV感染。这导致细菌向肺部传播、肺部炎症和可进展为致命的明显疾病迹象。疾病程度取决于细菌菌株和宿主因素。
重要的是,该模型再现了衰老的易感性,因为与年轻小鼠相比,老年小鼠表现出更严重的临床疾病并且更频繁地屈服于疾病。通过将携带和疾病分成不同的步骤,并提供分析病原体和宿主的遗传变异的机会,这种 肺炎链球菌/IAV合并感染模型允许详细检查重要病理在疾病进展的不同阶段与宿主的相互作用。该模型还可以作为确定易感宿主继发性肺炎球菌肺炎潜在治疗靶点的重要工具。
肺炎链球菌(肺炎球菌)是革兰氏阳性细菌,无症状地存在于大多数健康个体的鼻咽中1,2。在尚未完全确定的因素的促进下,肺炎球菌可以从鼻咽的良性定植者转变为扩散到其他器官的病原体,从而导致严重感染,包括中耳炎、肺炎和菌血症3。肺炎球菌疾病的表现部分取决于菌株特异性差异,包括基于荚膜多糖组成的血清型。到目前为止,已经有100多种血清型被鉴定,其中一些与更具侵袭性的感染有关4,5。其他几个因素会增加肺炎球菌疾病的风险。其中一个因素是病毒感染,其中肺炎球菌肺炎的风险增加 100 倍 IAV6,7。从历史上看,肺炎链球菌是流感后继发性细菌性肺炎的最常见原因之一,并且与更差的结果有关8。另一个主要危险因素是高龄。事实上,肺炎链球菌是65岁以上老年人社区获得性细菌性肺炎的主要原因9,10。老年人占肺炎和流感死亡的大多数(>75%),表明衰老和IAV感染这两个危险因素协同恶化疾病易感性11,12,13,14。然而,病毒感染促使肺炎球菌从无症状定植者转变为侵袭性病原体的机制以及宿主因素如何塑造的机制仍然不清楚。这主要是由于缺乏一个小动物模型来概括从无症状肺炎球菌定植到危重临床疾病的转变。
在流感感染后 7 天直接将肺炎球菌接种到肺部的小鼠中,经典地模拟了合并感染研究15,16。这再现了对继发性细菌性肺炎的易感性,是研究抗病毒免疫反应如何损害抗菌防御的理想选择17。然而,对人类的纵向研究表明,鼻咽部肺炎球菌携带,细菌可以形成无症状的生物膜18,与侵袭性疾病19,20一致相关。来自中耳、肺和血液感染的细菌分离株在基因上与鼻咽20 中发现的细菌分离株相同。因此,为了研究IAV感染后从无症状携带到侵袭性疾病的转变,建立了一个模型,其中小鼠鼻内施用生物膜生长的肺炎球菌,然后鼻咽部IAV感染21,22。上呼吸道的病毒感染导致宿主环境发生变化,导致肺炎球菌从生物膜中扩散并扩散到下呼吸道21。这些分散的细菌上调了对感染很重要的毒力因子的表达,将它们从定植者转化为病原体21。这些观察结果突出了病毒、宿主和细菌之间的复杂相互作用,并表明病毒感染引发的宿主变化对肺炎球菌行为有直接影响,这反过来又改变了细菌感染的过程。然而,该模型未能概括在人类中观察到的严重疾病迹象,可能是因为病毒仅限于鼻腔,并且病毒感染对宿主免疫和肺损伤的全身影响没有被概括。
我们最近建立了一个模型,该模型结合了宿主和病原体之间的复杂相互作用,但也更贴近地模仿了在人类中观察到的疾病严重程度23。在该模型中,小鼠首先鼻内感染生物膜生长的肺炎球菌以建立无症状携带,然后鼻咽和肺部的IAV感染。这导致细菌传播到肺部,肺部炎症和疾病在一小部分年轻小鼠中发展为致死率23。先前的研究表明,病毒和细菌感染都改变了宿主的防御:病毒感染促进了细菌传播,先前的细菌定植损害了宿主控制肺部IAV水平的能力23。检查免疫反应显示,IAV感染降低了中性粒细胞的抗菌活性,而细菌定植削弱了对抗病毒防御至关重要的I型干扰素反应23。重要的是,该模型再现了衰老的易感性。与年轻小鼠相比,老年小鼠表现出更早的疾病迹象,表现出更严重的临床疾病,并且更频繁地死于感染23。本手稿中介绍的工作表明,疾病程度也取决于细菌菌株,因为与非侵入性菌株相比,侵袭性肺炎球菌菌株在IAV感染时显示出更有效的传播,显示出更明显的肺部炎症迹象,并导致疾病发病率加快。因此,这种 肺炎链球菌/IAV混合感染模型允许详细检查病原体和宿主因素,并且非常适合研究疾病进展不同阶段对多种微生物感染的免疫反应。
大多数现有的肺炎链球菌/IAV混合感染实验研究依赖于细菌递送到感染IAV的小鼠肺部。这些模型有助于识别肺部环境和全身免疫反应的变化,使宿主容易发生继发性细菌感染15,16,17,32,33,34,35,36,37。然而,这些模型未能模拟肺炎链球菌从无症状定植者转变为能够引起严重肺部和全身感染的病原体。此外,这些模型不适合研究上呼吸道中导致感染易感性的宿主因素和宿主-病原体相互作用。IAV感染后肺炎球菌从鼻咽移动到肺部的先前模型依赖于鼻咽细菌感染,然后是病毒感染。然而,它未能重现在人类患者中观察到的严重疾病迹象21。这里描述的改良鼠感染模型概括了肺炎链球菌从无症状携带到导致严重临床疾病的病原体的转变。
该模型的一个关键步骤是确定鼻咽部的肺炎链球菌感染。肺炎链球菌形成生物膜并以不同的效率定植鼻咽21,38。为了建立一致的感染,至少需要5 × 106 CFU的生物膜生长细菌菌株迄今为止测试23。建议在病毒感染之前检测任何新的细菌菌株是否稳定感染鼻咽。对于病毒合并感染,先前的研究发现,鼻内IAV感染是鼻咽细菌从鼻咽21,22,23传播所必需的。在之前的研究中,使用500 PFU的IAV用于鼻内输送,而在本研究中,200 PFU足以增加鼻咽中的细菌数量。IAV感染不仅限于上呼吸道,还可以扩散到肺部39,40,这是使肺部环境更易于细菌感染的关键15,16,41。IAV向肺部的递送可以通过鼻内递送或麻醉小鼠的气管内安装来实现。先前对BALB / cByJ小鼠的研究发现鼻内递送导致病毒性肺炎21;然而,在C57BL / 6小鼠中,鼻内接种后接种物进入肺部的途径受到更多限制。在C57BL / 6小鼠中,需要气管内安装以一致地传递病毒23。在该模型中,先前的细菌定植加速了病毒感染后疾病症状的呈现23。由于病毒感染本身可引起疾病症状,动力学可能发生变化,因此建议首先测试任何新病毒株的剂量范围,并选择揭示混合感染宿主中加速动力学的剂量。
在该模型中,肺为疾病评估提供了另一个关键读数。为了评估病原体负荷和免疫细胞内流,可以使用来自同一只小鼠的肺。但是,由于不同肺叶之间的感染和炎症严重程度可能不同,因此建议不要将同一肺的不同肺叶用于各种评估。相反,所有的裂片都可以切成小块,混合在一起,然后平均解析出来以进行不同的评估。同样,鼻咽可用于细菌CFU或病毒PFU的计数和免疫应答。然而,从洗涤液和组织中获得的细胞数量太少,无法在不汇集来自同一组小鼠的样品的情况下进行流式细胞术。或者,可以组织学评估鼻咽部炎症23。
该模型的一个关键特征是它概括了患者身上看到的临床疾病。在人类中,IAV 感染后的继发性肺炎球菌肺炎通常会导致明显的疾病体征,包括咳嗽、呼吸困难、发烧和肌肉酸痛,可导致住院、呼吸衰竭甚至死亡8,15,42,43。该模型概括了在人类中观察到的临床疾病的严重迹象,包括小鼠表现出的呼吸困难(反映在呼吸评分)和整体不适(反映在姿势和运动评分中),以及一些健康的年轻对照组的死亡。合并感染小鼠的疾病症状加重可能是细菌传播到肺部和肺炎球菌携带小鼠病毒清除受损的结果23。该模型的局限性在于,临床疾病和鼻咽细菌传播的发生率因小鼠而异,并受细菌菌株、宿主年龄和基因型21、22、23 的影响。反映这一点,对于侵袭性菌株,从局部感染(没有检测到的菌血症)到死亡的进展可以在24小时内发生。因此,为了真正评估全身传播,应在较短的时间间隔内(每6-12小时)随访菌血症。同样,疾病评分可以迅速变化,特别是在合并感染后的前 72 小时内。因此,为了密切跟踪疾病症状,建议在IAV感染后第1-3天每天监测小鼠三次。
总之,该模型复制了 肺炎链球菌 从鼻咽的无症状定植者到能够在IAV感染时引起肺部和全身疾病的病原体的移动。在该模型中,IAV通过改变鼻咽中的细菌行为,增加细菌向肺部的传播以及改变抗菌免疫力 来触发肺炎链球菌 的转变23。同样,细菌携带会减弱抗病毒免疫反应并损害肺部的IAV清除率23。这使得该模型非常适合分析单一感染与多种微生物感染中免疫反应的变化。此外,合并感染后的病程部分取决于鼻咽部存在的肺炎球菌菌株。因此,该模型适用于剖析 肺炎链球菌 无症状定植与致病性转化所需的细菌因素。最后,该模型再现了衰老对合并感染的易感性,尽管此处未对其进行测试,但它可以很容易地用于评估宿主背景对疾病过程的影响。总之,将携带和疾病分成不同的步骤提供了分析病原体和宿主的遗传变异的机会,从而可以详细检查重要病理剂在疾病进展不同阶段与宿主的相互作用。展望未来,该模型可用于为易受攻击的宿主量身定制治疗方案。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢尼克·伦哈德对这份手稿的批判性阅读和编辑。我们还要感谢Andrew Camilli和Anthony Campagnari的细菌菌株和Bruce Davidson的病毒菌株。这项工作得到了国家卫生研究院对J.L.的拨款(R21AG071268-01)和国家卫生研究院对E.N.B.G.的资助(R21AI145370-01A1),(R01AG068568-01A1),(R21AG071268-01)的支持。
4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
BD Fortessa | Flow cytometer | ||
BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
MilQ water | Ultra-pure water | ||
Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |