İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM’lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.
İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir. Bu nedenle, uygun preklinik kardiyak güvenlik değerlendirme modellerinin kullanılması, ilaç geliştirme sırasında kritik bir adımdır. Şu anda, kardiyak güvenlik değerlendirmesi hala hayvan çalışmalarına büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modelleri, özellikle kardiyak elektrofizyolojik özellikler açısından, türe özgü farklılıklar nedeniyle, insanlara zayıf translasyonel özgüllükten muzdariptir. Bu nedenle, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için paha biçilmez bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. hiPSC-CM’ler, farklı genetik geçmişlere ve çeşitli hastalıklı koşullara sahip bireylerden elde edilebilir, bu da onları ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi ayrı ayrı değerlendirmek için ideal bir vekil haline getirir. Bu nedenle, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturulmalıdır. Bu protokolde, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum işleme ölçümü de dahil olmak üzere hiPSC-CM’ler üzerinde değerlendirilebilecek çeşitli fonksiyonel testleri detaylandırıyoruz. Genel olarak, hiPSC-CM’lerin klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesine dahil edilmesi, ilaç geliştirmede devrim yaratma potansiyeline sahiptir.
İlaç geliştirme uzun ve pahalı bir süreçtir. 2009 ve 2018 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan yeni terapötik ilaçların bir çalışması, kapitalize edilmiş araştırma ve klinik çalışmaların tahmini medyan maliyetinin ürün başına 985 milyon dolar olduğunu bildirmiştir1. İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir2. Özellikle, kardiyotoksisite birden fazla terapötik ilaç sınıfı arasında bildirilmiştir3. Bu nedenle, kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. Kardiyak güvenlik değerlendirmesi için mevcut paradigma hala hayvan modellerine büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modellerinin kullanımından kaynaklanan tür farklılıkları, insan hastalarında ilaca bağlı kardiyotoksisite için yanlış tahminlerin birincil nedeni olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir4. Örneğin, kardiyak aksiyon potansiyelinin morfolojisi, farklı repolarize akımların katkıları nedeniyle insanlar ve fareler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir5. Ek olarak, kardiyak miyozin ve dairesel RNA’ların kardiyak fizyolojiyi etkileyebilecek diferansiyel izoformları,türler arasında iyi belgelenmiştir 6,7. Bu boşlukları kapatmak için, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model oluşturmak zorunludur.
İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin çığır açan icadı, benzeri görülmemiş ilaç tarama ve hastalık modelleme platformları oluşturmuştur. Son on yılda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM’ler) üretme yöntemleri iyi kurulmuş 8,9 haline gelmiştir. hiPSC-CM’ler, hastalık modelleme, ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hassas tıptaki potansiyel uygulamalarına büyük ilgi duymuştur. Örneğin, uzun QT sendromu 10, hipertrofik kardiyomiyopati 11,12 ve dilate kardiyomiyopati 13,14,15 gibi genetik kalıtımın neden olduğu kalp hastalıklarının patolojik fenotiplerini modellemek için hiPSC-CM’ler kullanılmıştır. Sonuç olarak, kalp hastalıklarının patogenezinde rol oynayan ve etkili tedavi için potansiyel terapötik stratejilere ışık tutabilecek anahtar sinyal yolları tanımlanmıştır. Ayrıca, hiPSC-CM’ler, doksorubisin, trastuzumab ve tirozin kinaz inhibitörleri16,17,18 dahil olmak üzere antikanser ajanlarla ilişkili ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi taramak için kullanılmıştır; Ortaya çıkan kardiyotoksisiteyi hafifletmek için stratejiler araştırılmaktadır. Son olarak, hiPSC-CM’lerde tutulan genetik bilgi, ilaca bağlı kardiyotoksisitenin hem bireysel hem de popülasyon seviyelerindetaranmasına ve tahmin edilmesine izin verir 19,20. Toplu olarak, hiPSC-CM’lerin kişiselleştirilmiş kardiyak güvenlik tahmini için paha biçilmez bir araç olduğu kanıtlanmıştır.
Bu protokolün genel amacı, hiPSC-CM’lerin hastalık modellemesine, ilaca bağlı kardiyotoksisite taramasına ve hassas tıbba uygulanmasında büyük önem taşıyan hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı ve verimli bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturmaktır. Burada, hiPSC-CM’lerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum (Ca2+) kullanımının ölçümü de dahil olmak üzere bir dizi fonksiyonel tahlili detaylandırıyoruz (Şekil 1).
İnsan iPSC teknolojisi, hastalık modelleme ve ilaç taraması için güçlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM kontraktilitesini, alan potansiyelini, aksiyon potansiyelini ve Ca2 + geçicisini ölçmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hiPSC-CM kontraktilitesinin ve elektrofizyolojisinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bu fonksiyonel testler grubumuzun 12,13,18,24,25,26,27…
The authors have nothing to disclose.
Blake Wu’ya el yazmasını düzelttiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 ve NASA NNX16A069A (JCW) ve AHA Doktora Sonrası Burs 872244 (GMP) tarafından desteklenmiştir.
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
NIS Elements AR | |||
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |