Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos
Summary
Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.
Abstract
La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado. Por lo tanto, el uso de modelos preclínicos apropiados de evaluación de seguridad cardíaca es un paso crítico durante el desarrollo de fármacos. Actualmente, la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los estudios en animales. Sin embargo, los modelos animales están plagados de poca especificidad traslacional para los humanos debido a las diferencias específicas de la especie, particularmente en términos de características electrofisiológicas cardíacas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro invaluable para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Los hiPSC-CM se pueden obtener de individuos con diversos antecedentes genéticos y diversas afecciones enfermas, lo que los convierte en un sustituto ideal para evaluar individualmente la cardiotoxicidad inducida por fármacos. Por lo tanto, es necesario establecer metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de las hiPSC-CM. En este protocolo, detallamos varios ensayos funcionales que pueden evaluarse en hiPSC-CM, incluida la medición de contractilidad, potencial de campo, potencial de acción y manejo de calcio. En general, la incorporación de hiPSC-CM en la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca tiene el potencial de revolucionar el desarrollo de fármacos.
Introduction
El desarrollo de fármacos es un proceso largo y costoso. Un estudio de nuevos medicamentos terapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) entre 2009 y 2018 informó que el costo medio estimado de la investigación capitalizada y los ensayos clínicos fue de $ 985 millones por producto1. La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado2. En particular, la cardiotoxicidad es reportada entre múltiples clases de fármacos terapéuticos3. Por lo tanto, la evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. El paradigma actual para la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los modelos animales. Sin embargo, las diferencias de especies con respecto al uso de modelos animales son cada vez más reconocidas como una causa primaria de predicciones inexactas para la cardiotoxicidad inducida por fármacos en pacientes humanos4. Por ejemplo, la morfología del potencial de acción cardíaca difiere sustancialmente entre humanos y ratones debido a las contribuciones de diferentes corrientes de repolarización5. Además, las isoformas diferenciales de miosina cardíaca y ARN circulares que pueden afectar la fisiología cardíaca han sido bien documentadas entre las especies 6,7. Para cerrar estas brechas, es imperativo establecer un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca.
La innovadora invención de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha generado plataformas sin precedentes de detección de fármacos y modelado de enfermedades. Durante la última década, los métodos para generar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) sehan establecido bien 8,9. Los hiPSC-CM han atraído un gran interés en sus aplicaciones potenciales en el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y la medicina de precisión. Por ejemplo, los hiPSC-CM se han utilizado para modelar los fenotipos patológicos de las enfermedades cardíacas causadas por la herencia genética, como el síndrome de QT largo10, la miocardiopatía hipertrófica 11,12 y la miocardiopatía dilatada13,14,15. En consecuencia, se han identificado vías de señalización clave implicadas en la patogénesis de las enfermedades cardíacas, que pueden arrojar luz sobre posibles estrategias terapéuticas para un tratamiento efectivo. Además, los hiPSC-CM se han utilizado para detectar cardiotoxicidad inducida por fármacos asociada con agentes anticancerosos, incluyendo doxorrubicina, trastuzumab e inhibidores de la tirosina cinasa16,17,18; Se están investigando estrategias para mitigar la cardiotoxicidad resultante. Finalmente, la información genética retenida en los hiPSC-CMs permite el tamizaje y la predicción de la cardiotoxicidad inducida por fármacos tanto a nivel individual como poblacional19,20. En conjunto, los hiPSC-CM han demostrado ser una herramienta invaluable para la predicción personalizada de la seguridad cardíaca.
El objetivo general de este protocolo es establecer metodologías para investigar de manera integral y eficiente las características funcionales de las hiPSC-CM, que son de gran importancia en la aplicación de hiPSC-CM hacia el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por medicamentos y la medicina de precisión. Aquí, detallamos una serie de ensayos funcionales para evaluar las propiedades funcionales de los hiPSC-CM, incluida la medición de la contractilidad, el potencial de campo, el potencial de acción y el manejo del calcio (Ca2+) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnología iPSC humana se ha convertido en una plataforma poderosa para el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Aquí, describimos un protocolo detallado para medir la contractilidad de hiPSC-CM, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+. Este protocolo proporciona una caracterización integral de la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CM. Estos ensayos funcionales han sido aplicados en múltiples publicaciones de nuestro grupo 12,13,18,24,25,26,27.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Blake Wu por corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 y NASA NNX16A069A (JCW), y AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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