Larvas de pez cebra como modelo para evaluar posibles radiosensibilizadores o protectores

Summary

El pez cebra ha sido explotado recientemente como modelo para validar posibles modificadores de radiación. El presente protocolo describe los pasos detallados para utilizar embriones de pez cebra para experimentos de detección basados en radiación y algunos enfoques observacionales para evaluar el efecto de diferentes tratamientos y radiación.

Abstract

El pez cebra se utiliza ampliamente en varios tipos de investigación porque es uno de los modelos de vertebrados de fácil mantenimiento y exhibe varias características de un sistema de modelos único y conveniente. Dado que las células altamente proliferativas son más susceptibles al daño del ADN inducido por la radiación, los embriones de pez cebra son un modelo in vivo de primera línea en la investigación de la radiación. Además, este modelo proyecta el efecto de la radiación y de diferentes fármacos en poco tiempo, junto con los principales eventos biológicos y las respuestas asociadas. En varios estudios oncológicos se ha utilizado el pez cebra, y este protocolo se basa en el uso de modificadores de radiación en el contexto de la radioterapia y el cáncer. Este método se puede utilizar fácilmente para validar los efectos de diferentes fármacos en embriones irradiados y de control (no irradiados), identificando así los fármacos como fármacos radiosensibilizantes o protectores. Aunque esta metodología se utiliza en la mayoría de los experimentos de detección de fármacos, los detalles del experimento y la evaluación de la toxicidad con el trasfondo de la exposición a la radiación de rayos X son limitados o sólo se abordan brevemente, lo que dificulta su realización. Este protocolo aborda este problema y analiza el procedimiento y la evaluación de la toxicidad con una ilustración detallada. El procedimiento describe un enfoque simple para el uso de embriones de pez cebra para estudios de radiación y detección de fármacos basados en radiación con mucha confiabilidad y reproducibilidad.

Introduction

El pez cebra (Danio rerio) es un modelo animal muy conocido que ha sido ampliamente utilizado en la investigación durante las últimas 3 décadas. Es un pequeño pez de agua dulce que es fácil de criar y criar en condiciones de laboratorio. El pez cebra ha sido ampliamente utilizado para diversos estudios toxicológicos y de desarrollo 1,2,3,4,5,6,7,8. El pez cebra tiene alta fecundidad y corta generación embrionaria; Los embriones son adecuados para el seguimiento de diferentes etapas de desarrollo, son visualmente transparentes y son susceptibles a variedades de manipulación genética y plataformas de cribado de alto rendimiento 9,10,11,12,13,14. Además, el pez cebra proporciona imágenes in toto y en vivo para las cuales su proceso de desarrollo y diferentes deformidades en presencia de diversas sustancias o factores tóxicos pueden ser fácilmente estudiados utilizando microscopía estereoscópica o fluorescente 7,15,16.

La radioterapia es uno de los principales modos terapéuticos utilizados en el tratamiento del cáncer 17,18,19,20,21,22,23,24. Sin embargo, la radioterapia contra el cáncer requiere radioprotectores potenciales para proteger a las células sanas normales de la muerte mientras matan las células malignas o salvaguardar la salud humana durante la terapia que involucra radiaciones de alta energía 25,26,27,28,29. Por el contrario, también se están investigando radiosensibilizadores potentes para aumentar la eficiencia de la radiación para matar células malignas, especialmente en terapias dirigidas y de precisión^30,31,32,33. Por lo tanto, para validar radioprotectores y sensibilizadores potentes, se solicita encarecidamente un modelo adecuado para el cribado de fármacos de semi-alto rendimiento y que exhiba efectos de radiación de forma mensurable. Varios modelos disponibles se utilizan en estudios de radiación y participan en experimentos de detección de fármacos. Sin embargo, los vertebrados superiores e incluso el modelo in vivo más utilizado, los ratones, no son adecuados para el cribado de fármacos a gran escala porque requiere mucho tiempo, es costoso y difícil diseñar dichos experimentos de cribado con estos modelos. Del mismo modo, los modelos de cultivo celular son ideales para variedades de experimentos de cribado de fármacos de alto rendimiento^34,35. Sin embargo, los experimentos que involucran cultivos celulares no siempre son pragmáticos, altamente reproducibles o confiables, ya que las células en cultivo pueden cambiar notablemente su comportamiento de acuerdo con las condiciones de crecimiento y la cinética. Además, las variedades de tipos celulares muestran sensibilización diferencial a la radiación. Cabe destacar que los sistemas de cultivo celular 2D y 3D no representan el escenario de todo el organismo y, por lo tanto, los resultados obtenidos pueden no recapitular el nivel real de radiotoxicidad^36,37. En este sentido, el pez cebra ofrece varias ventajas en la detección de nuevos radiosensibilizadores y radioprotectores. La facilidad de manejo, el gran tamaño de la nidada, la corta vida útil, el rápido desarrollo embrionario, la transparencia del embrión y el pequeño tamaño corporal hacen del pez cebra un modelo adecuado para la detección de drogas a gran escala. Debido a las ventajas anteriores, los experimentos se pueden repetir fácilmente en poco tiempo y el efecto se puede observar fácilmente bajo un microscopio de disección en placas de pocillos múltiples. Por lo tanto, el pez cebra está ganando popularidad en la investigación de detección de drogas que involucra estudios de radiación^38,39.

El potencial del pez cebra como modelo de buena fe para detectar modificadores de radiación ha sido demostrado en diversos estudios 40,41,42,43,44,45. Se ha descrito el efecto radioprotector de potenciales modificadores de radio, como la nanopartícula DF1, la amifostina (WR-2721), las proteínas de reparación del ADN KU80 y ATM, y las células madre hematopoyéticas trasplantadas, y los efectos de los radiosensibilizadores, como el flavopiridol y AG1478, en el modelo de pez cebra 19,41,42,43,44,45,46 . Utilizando el mismo sistema, se evaluó el efecto radioprotector de DF-1 (nanopartícula de fullereno) tanto a nivel sistémico como a nivel específico de órganos, y también se exploró más a fondo el uso de embriones de pez cebra para el cribado radioprotector⁴⁷. Recientemente, se informó que la miel de Kelulut es un radioprotector en embriones de pez cebra y se descubrió que aumenta la supervivencia del embrión y previene el daño específico de los órganos, el daño del ADN celular y la apoptosis⁴⁸.

Del mismo modo, los efectos radioprotectores de los polímeros generados a través de la reacción de Hantzsch se comprobaron en embriones de pez cebra en un cribado de alto rendimiento, y la protección se confirió principalmente protegiendo a las células del daño en el ADN⁴⁹. En uno de los estudios previos, se encontró la estatina lipofílica fluvastatina como potencial radiosensibilizante utilizando el modelo de pez cebra con este abordaje⁵⁰. Del mismo modo, las nanopartículas de oro se consideran un radiosensibilizador ideal y se han utilizado en muchos estudios^51,52.

El desarrollo embrionario en el pez cebra implica la escisión en las 3 h iniciales en las que un cigoto unicelular se divide para formar 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, 32 células y 64 células que se identifican fácilmente con un microscopio estereoscópico. Luego, alcanza la etapa de blástula con 128 células (2.25 h después de la fertilización, hpf), donde las células se duplican cada 15 min y pasan por las siguientes etapas: 256 células (2.5 hpf), 512 células (2.75 hpf) y alcanzando 1,000+ células en solo 3 h (Figura 1). A las 4 h, el huevo alcanza la etapa de esfera, seguida de la formación de una cúpula en la masa embrionaria 7,53,54. La gastrulación en el pez cebra comienza a partir de 5,25 hpf⁵⁴, donde alcanza la etapa de escudo. El escudo indica claramente el rápido movimiento de convergencia de las células hacia un lado del anillo germinal (Figura 1) y es una fase prominente y distinta de los embriones gastrulados que se puede identificar fácilmente^53,54. Aunque la exposición a la radiación de los embriones podría realizarse en cualquier etapa de su desarrollo, la exposición a la radiación durante la gastrulación podría tener cambios morfológicos más marcados, lo que facilitaría una mejor lectura de las toxicidades inducidas por la radiación⁵⁵; Del mismo modo, la administración de fármacos a embriones puede iniciarse a partir de las 2 HPF⁵⁴.

Protocol

El presente estudio se llevó a cabo con la aprobación previa del Comité Institucional de Ética Animal del Instituto de Ciencias de la Vida de Bhubaneswar y siguiendo las directrices. Todo el mantenimiento y la cría del pez cebra se llevaron a cabo en una instalación de cultivo de peces a temperatura ambiente a 28,5 °C, y los embriones se mantuvieron en una incubadora de demanda biológica de oxígeno (DBO) a una temperatura de 28,5 °C. En este caso, se utilizó la cepa AB de pez cebra y la estadificación se lle…

Representative Results

El diseño general del protocolo se muestra en la Figura 2. El efecto de la radiación y la caracterización de manera dosis-dependiente se evaluó con los siguientes análisis. Evaluación de las toxicidades inducidas por rayos XUtilizando un microscopio estereoscópico, se evaluaron y caracterizaron las siguientes anomalías después del tratamiento farmacológico y/o la radiación. De acuerdo con las directrices 61 de la O…

Discussion

El pez cebra se utiliza como modelos valiosos en muchos estudios, incluidos varios tipos de investigación sobre el cáncer. Este modelo proporciona una plataforma útil para el cribado de drogas a gran escala^67,68. Al igual que cualquier otro método de evaluación de la toxicidad, la evaluación cuantitativa de los principales cambios biológicos tras el tratamiento con radiación y/o fármacos es la parte más crucial de este protocolo. En este tipo de estudio…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL