ゼブラフィッシュの幼生を潜在的な放射線増感剤またはプロテクターを評価するためのモデルとして
Summary
ゼブラフィッシュは最近、潜在的な放射線修飾因子を検証するためのモデルとして利用されています。本プロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚を放射線ベースのスクリーニング実験に使用する詳細な手順と、さまざまな治療と放射線の効果を評価するためのいくつかの観察アプローチについて説明します。
Abstract
ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデルとしては維持が容易であり、ユニークで便利なモデルシステムの特徴を示すため、さまざまな研究に広く利用されています。増殖性の高い細胞は放射線によるDNA損傷を受けやすいため、ゼブラフィッシュの胚は放射線研究の最前線の in vivo モデルです。さらに、このモデルは、主要な生物学的事象と関連する応答とともに、放射線とさまざまな薬物の影響を短時間で予測します。いくつかのがん研究でゼブラフィッシュが使用されており、このプロトコルは、放射線療法とがんの文脈での放射線修飾剤の使用に基づいています。この方法は、放射線照射された胚と対照胚(非照射)に対するさまざまな薬物の効果を検証するために容易に使用でき、したがって、薬物を放射線増感薬または保護薬として識別します。この手法は、ほとんどの薬物スクリーニング実験で用いられていますが、実験の詳細やX線被曝を背景とした毒性評価は、限定的であるか、短時間しか取り上げられていないため、実施が困難でした。このプロトコルでは、この問題に対処し、手順と毒性評価について詳細な図で説明します。この手順では、ゼブラフィッシュの胚を放射線研究や放射線ベースの薬物スクリーニングに使用し、高い信頼性と再現性を実現するための簡単なアプローチを説明しています。
Introduction
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、過去30年間にわたって研究で広く使用されてきた有名な動物モデルです。実験室の条件下で飼育や繁殖が簡単な小型の淡水魚です。ゼブラフィッシュは、さまざまな発生および毒物学的研究に広く使用されています1,2,3,4,5,6,7,8。ゼブラフィッシュは繁殖力が高く、胚発生が短いです。胚は、さまざまな発生段階の追跡に適しており、視覚的に透明であり、さまざまな遺伝子操作およびハイスループットスクリーニングプラットフォーム9,10,11,12,13,14に適しています。さらに、ゼブラフィッシュは、その発生過程とさまざまな有毒物質または因子の存在下でのさまざまな奇形を実体顕微鏡または蛍光顕微鏡法を使用して簡単に研究できるトトおよびライブイメージングを提供します7,15,16。
放射線療法は、がんの治療に使用される主要な治療法の1つです17、18、19、20、21、22、23、24。しかし、がん放射線治療では、悪性細胞を殺しながら正常な健康な細胞を死滅から守ったり、高エネルギー放射線を含む治療中に人間の健康を保護したりするための潜在的な放射線防護剤が必要です25,26,27,28,29。逆に、強力な放射線増感剤は、特に標的療法や精密治療において、悪性細胞を殺すための放射線の効率を高めるために研究されています30,31,32,33。したがって、強力な放射線防護剤と増感剤を検証するために、セミハイスループットの薬物スクリーニングに適しており、放射線効果を測定可能に示すモデルが強く求められています。いくつかの利用可能なモデルは、放射線研究で使用され、薬物スクリーニング実験に関与しています。しかし、高等脊椎動物や、最も一般的に使用されているin vivoモデルであるマウスでさえ、これらのモデルを用いたスクリーニング実験の設計には時間とコストがかかり、困難であるため、大規模な薬物スクリーニングには適していません。同様に、細胞培養モデルは、さまざまなハイスループット薬物スクリーニング実験に理想的です34,35。しかし、細胞培養を含む実験は、培養中の細胞が増殖条件や動態に応じて挙動を著しく変化させる可能性があるため、必ずしも実用的、再現性が高く、信頼性が高いとは限りません。また、さまざまな種類の細胞が差動放射線感作を示します。特に、2Dおよび3D細胞培養システムは生物全体のシナリオを表していないため、得られた結果は実際の放射毒性のレベルを再現していない可能性があります36,37。この点で、ゼブラフィッシュは、新規の放射線増感剤および放射線防護剤のスクリーニングにおいていくつかの利点を提供します。取り扱いの容易さ、大きなクラッチサイズ、短い寿命、急速な胚発生、胚の透明性、および小さな体サイズにより、ゼブラフィッシュは大規模な薬物スクリーニングに適したモデルになっています。以上の利点により、実験を短時間で容易に繰り返すことができ、マルチウェルプレートの解剖顕微鏡下で容易に効果を観察することができる。したがって、ゼブラフィッシュは放射線研究を含む薬物スクリーニング研究で人気を集めています38,39。
放射線修飾剤をスクリーニングするための正真正銘のモデルとしてのゼブラフィッシュの可能性は、さまざまな研究で実証されています40,41,42,43,44,45。ゼブラフィッシュモデルでは、ナノ粒子DF1、アミフォスチン(WR-2721)、DNA修復タンパク質KU80、ATM、移植造血幹細胞などの潜在的な放射線修飾剤の放射線防護効果、およびフラボピリドールやAG1478などの放射線増感剤の効果が報告されています19,41,42,43,44,45,46.同じシステムを用いて、DF-1(フラーレンナノ粒子)の放射線防護効果を全身レベルと臓器特異的レベルの両方で評価し、放射線防護体スクリーニングのためのゼブラフィッシュ胚の使用もさらに調査された47。最近、ケルルート蜂蜜はゼブラフィッシュの胚の放射線防護剤として報告され、胚の生存率を高め、臓器特異的な損傷、細胞DNAの損傷、およびアポトーシスを防ぐことがわかった48。
同様に、ハンチの反応によって生成されたポリマーの放射線防護効果は、ゼブラフィッシュの胚でハイスループットスクリーニングでチェックされ、その保護は主に細胞をDNA損傷から保護することによって与えられた49。以前の研究の1つでは、親油性スタチンフルバスタチンが、このアプローチでゼブラフィッシュモデルを使用して潜在的な放射線増感剤として発見されました50。同様に、金ナノ粒子は理想的な放射線増感剤であると考えられており、多くの研究で使用されています51,52。
ゼブラフィッシュの胚発生は、単細胞の受精卵が分裂して2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、32細胞、64細胞を形成する最初の3時間での切断を伴い、実体顕微鏡で容易に識別できます。その後、128個の細胞(受精後2.25時間、hpf)で胞胚期に達し、細胞は15分ごとに倍増し、256細胞(2.5hpf)、512細胞(2.75hpf)、わずか3時間で1,000+細胞に達します(図1)。4時間で、卵は球の段階に達し、続いて胚の塊7,53,54にドーム形状が形成されます。ゼブラフィッシュの原腸形成は5.25 hpf54から始まり、そこでシールド段階に達します。シールドは、生殖輪の片側への細胞の急速な収束移動を明確に示しており(図1)、容易に識別できるガスtrulate胚の顕著で明確な段階です53,54。胚への放射線被曝は発生のどの段階でも起こりうるが、原腸形成中の放射線被曝は、より明瞭な形態学的変化を有し、放射線誘発毒性のより良い読み出しを容易にする可能性がある55。同様に、胚への薬物投与は、早ければ2HPF54から開始することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、数種類のがん研究を含む多くの研究で貴重なモデルとして使用されています。このモデルは、大規模な薬物スクリーニングのための有用なプラットフォームを提供する67,68。他の毒性評価法と同様に、放射線および/または薬物治療時の主要な生物学的変化の定量的評価は、このプロトコルの最も重要な部分です。この種の研?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SSの研究室とRKSの研究室は、インドのDBTとSERBからの助成金によって資金提供されています。APMは、インド政府のICMRフェローシップの受賞者です。DPは、インド政府のCSIRフェローシップの受賞者です。国連は、インド政府であるDST-Inspireフェローシップの受賞者です。 図 2 は Biorender (https://biorender.com) を使用して生成しました。
Materials
| 6 Well plates | Corning | CLS3335 | Polystyrene |
| B.O.D Incubator | Oswald | JRIC-10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | 10101-41-4 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| External Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTE | Polycarbonate |
| Glass petriplates | Borosil | 3165A75 | Glass |
| GraphpadPrism | GraphPad Software, Inc. | Version 5.01 | |
| Kline concavity slides | Himedia | GW092-1PK | Glass |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Methylene blue hydrate | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm | Tarsons | 380020 | Paraffin film |
| Pasteur pipettes | Himedia | PW1212-1X500NO | Polyethylene plastic |
| Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTI | Polycarbonate |
| Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTD | Polycarbonate |
| Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank | Tecniplast | ZB10BTL | Polycarbonate |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide pellet | SRL | 1949181 | |
| Stereo Microscope Leica M205FA | Leica | Model/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 Precision X-Ray | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
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