Zebrafischlarven als Modell zur Bewertung potenzieller Radiosensibilisatoren oder Protektoren

Summary

Der Zebrafisch wurde kürzlich als Modell zur Validierung potenzieller Strahlungsmodifikatoren genutzt. Das vorliegende Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte zur Verwendung von Zebrafischembryonen für strahlenbasierte Screening-Experimente und einige Beobachtungsansätze, um die Wirkung verschiedener Behandlungen und Bestrahlungen zu bewerten.

Abstract

Zebrafische werden häufig in verschiedenen Arten der Forschung verwendet, da sie zu den am einfachsten zu wartenden Wirbeltiermodellen gehören und mehrere Merkmale eines einzigartigen und praktischen Modellsystems aufweisen. Da hochproliferative Zellen anfälliger für strahleninduzierte DNA-Schäden sind, sind Zebrafischembryonen ein vorderstes In-vivo-Modell in der Strahlenforschung. Darüber hinaus projiziert dieses Modell die Wirkung von Strahlung und verschiedenen Medikamenten innerhalb kurzer Zeit sowie wichtige biologische Ereignisse und damit verbundene Reaktionen. In mehreren Krebsstudien wurden Zebrafische verwendet, und dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von Strahlungsmodifikatoren im Zusammenhang mit Strahlentherapie und Krebs. Diese Methode kann leicht verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Medikamente auf bestrahlte und kontrollierte (nicht bestrahlte) Embryonen zu validieren und so Medikamente als radiosensibilisierende oder schützende Medikamente zu identifizieren. Obwohl diese Methodik in den meisten Drogenscreening-Experimenten verwendet wird, werden die Details des Experiments und die Toxizitätsbewertung vor dem Hintergrund der Röntgenstrahlenbelastung nur begrenzt oder nur kurz behandelt, was die Durchführung erschwert. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Problem und erläutert das Verfahren und die Toxizitätsbewertung mit einer detaillierten Illustration. Das Verfahren beschreibt einen einfachen Ansatz zur Verwendung von Zebrafischembryonen für Strahlenstudien und strahlenbasiertes Wirkstoffscreening mit hoher Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit.

Introduction

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein bekanntes Tiermodell, das in den letzten 3 Jahrzehnten in der Forschung weit verbreitet war. Es handelt sich um einen kleinen Süßwasserfisch, der unter Laborbedingungen leicht aufzuziehen und zu züchten ist. Der Zebrafisch wurde ausgiebig für verschiedene entwicklungstechnische und toxikologische Studien verwendet 1,2,3,4,5,6,7,8. Der Zebrafisch hat eine hohe Fruchtbarkeit und eine kurze Embryonalgeneration; Die Embryonen eignen sich für die Verfolgung verschiedener Entwicklungsstadien, sind visuell transparent und eignen sich für verschiedene Arten von genetischer Manipulation und Hochdurchsatz-Screening-Plattformen 9,10,11,12,13,14. Darüber hinaus liefert der Zebrafisch In-toto- und Live-Bildgebung, für die sein Entwicklungsprozess und verschiedene Missbildungen in Gegenwart verschiedener toxischer Substanzen oder Faktoren mit Hilfe von Stereo- oder Fluoreszenzmikroskopie leicht untersucht werden^{können 7,15,16}.

Die Strahlentherapie ist eine der wichtigsten therapeutischen Methoden bei der Behandlung von Krebs 17,18,19,20,21,22,23,24. Die Strahlentherapie bei Krebs erfordert jedoch potenzielle Strahlenschützer, um normale gesunde Zellen vor dem Absterben zu schützen, während bösartige Zellen abgetötet werden, oder um die menschliche Gesundheit während einer Therapie mit hochenergetischer Strahlung zu schützen 25,26,27,28,29. Umgekehrt werden auch potente Radiosensibilisatoren untersucht, um die Effizienz der Bestrahlung zur Abtötung bösartiger Zellen zu erhöhen, insbesondere in zielgerichteten und präzisen Therapien^30,31,32,33. Um potente Strahlenschützer und Sensibilisatoren zu validieren, wird daher ein Modell gesucht, das für das Semi-Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening geeignet ist und messbare Strahleneffekte aufweist. Mehrere verfügbare Modelle werden in Strahlenstudien verwendet und an Wirkstoff-Screening-Experimenten beteiligt. Höhere Wirbeltiere und selbst das am häufigsten verwendete In-vivo-Modell, Mäuse, sind jedoch für ein groß angelegtes Wirkstoff-Screening ungeeignet, da es zeitaufwändig, kostspielig und schwierig ist, solche Screening-Experimente mit diesen Modellen zu entwerfen. In ähnlicher Weise sind Zellkulturmodelle ideal für verschiedene Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Experimente^34,35. Experimente mit Zellkultur sind jedoch nicht immer pragmatisch, hochgradig reproduzierbar oder zuverlässig, da Zellen in Kultur ihr Verhalten je nach Wachstumsbedingungen und Kinetik deutlich ändern können. Außerdem zeigen verschiedene Zelltypen eine differentielle Strahlungssensibilisierung. Insbesondere stellen 2D- und 3D-Zellkultursysteme nicht das gesamte Organismenszenario dar, so dass die erzielten Ergebnisse möglicherweise nicht den tatsächlichen Grad der Radiotoxizität rekapitulieren^36,37. In dieser Hinsicht bietet der Zebrafisch mehrere Vorteile beim Screening nach neuartigen Radiosensibilisatoren und Strahlenschutzmitteln. Die einfache Handhabung, die große Gelegegröße, die kurze Lebensdauer, die schnelle Embryonalentwicklung, die Transparenz des Embryos und die geringe Körpergröße machen den Zebrafisch zu einem geeigneten Modell für ein groß angelegtes Wirkstoffscreening. Aufgrund der oben genannten Vorteile können Experimente in kurzer Zeit problemlos wiederholt werden, und der Effekt kann leicht unter einem Präpariermikroskop in Multi-Well-Platten beobachtet werden. Daher gewinnt der Zebrafisch in der Drogenscreening-Forschung mit Strahlenstudien an Popularität^38,39.

Das Potenzial des Zebrafisches als echtes Modell für das Screening von Strahlungsmodifikatoren wurde in verschiedenen Studien nachgewiesen 40,41,42,43,44,45. Die strahlenschützende Wirkung potenzieller Radiomodifikatoren wie Nanopartikel DF1, Amifostin (WR-2721), DNA-Reparaturproteine KU80 und ATM sowie transplantierte hämatopoetische Stammzellen sowie die Wirkungen von Radiosensibilisatoren wie Flavopiridol und AG1478 im Zebrafischmodell wurden berichtet 19,41,42,43,44,45,46 . Mit dem gleichen System wurde die strahlenprotektive Wirkung von DF-1 (Fulleren-Nanopartikel) sowohl auf systemischer als auch auf organspezifischer Ebene untersucht, und auch die Verwendung von Zebrafischembryonen für das Strahlenschutz-Screening wurde weiter untersucht⁴⁷. Kürzlich wurde der Kelulut-Honig als Strahlenschutz in Zebrafischembryonen beschrieben und es wurde festgestellt, dass er das Überleben des Embryos erhöht und organspezifische Schäden, zelluläre DNA-Schäden und Apoptose verhindert⁴⁸.

In ähnlicher Weise wurden die strahlenprotektiven Effekte von Polymeren, die durch die Hantzsch-Reaktion erzeugt wurden, an Zebrafischembryonen in einem Hochdurchsatz-Screening überprüft, wobei der Schutz hauptsächlich durch den Schutz der Zellen vor DNA-Schäden gewährleistet wurde⁴⁹. In einer der vorangegangenen Studien wurde das lipophile Statin Fluvastatin als potenzieller Radiosensibilisator unter Verwendung des Zebrafischmodells mit diesem Ansatz gefunden⁵⁰. In ähnlicher Weise gelten Goldnanopartikel als idealer Radiosensibilisator und wurden in vielen Studien verwendet^51,52.

Die embryonale Entwicklung im Zebrafisch beinhaltet eine Spaltung in den ersten 3 Stunden, in denen sich eine einzellige Zygote teilt, um 2 Zellen, 4 Zellen, 8 Zellen, 16 Zellen, 32 Zellen und 64 Zellen zu bilden, die mit einem Stereomikroskop leicht identifiziert werden können. Dann erreicht es das Blastulastadium mit 128 Zellen (2,25 h nach der Befruchtung, hpf), in dem sich die Zellen alle 15 Minuten verdoppeln und die folgenden Stadien durchlaufen: 256 Zellen (2,5 hpf), 512 Zellen (2,75 hpf) und das Erreichen von 1.000+ Zellen in nur 3 h (Abbildung 1). Nach 4 Stunden erreicht die Eizelle das Kugelstadium, gefolgt von der Bildung einer Kuppelform in der embryonalen Masse 7,53,54. Die Gastrulation im Zebrafisch beginnt bei 5,25 hpf⁵⁴ und erreicht dort das Schildstadium. Der Schild zeigt deutlich die schnelle Konvergenzbewegung der Zellen zu einer Seite des Keimrings an (Abbildung 1) und ist eine prominente und ausgeprägte Phase der gastrulierenden Embryonen, die leicht identifiziert werden kann^53,54. Obwohl die Strahlenexposition von Embryonen in jedem Stadium ihrer Entwicklung erfolgen kann, könnte die Strahlenexposition während der Gastrulation deutlichere morphologische Veränderungen aufweisen, die eine bessere Ablesung strahleninduzierter Toxizitäten ermöglichen⁵⁵; In ähnlicher Weise kann mit der Verabreichung von Medikamenten an Embryonen bereits im Alter von 2 HPF⁵⁴ begonnen werden.

Protocol

Die vorliegende Studie wurde mit vorheriger Genehmigung und gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Ethical Committee, Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, durchgeführt. Die gesamte Pflege und Zucht von Zebrafischen wurde in einer Umgebungsfischzuchtanlage bei 28,5 °C durchgeführt, und die Embryonen wurden in einem Inkubator mit biologischem Sauerstoffbedarf (BSB) bei einer Temperatur von 28,5 °C gehalten. Hier wurde der Zebrafisch-AB-Stamm verwendet, und das Staging wurde nach Kimmel et <sup class="xre…

Representative Results

Das Gesamtlayout des Protokolls ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Wirkung der Bestrahlung und die dosisabhängige Charakterisierung wurde mit den folgenden Analysen bewertet. Bewertung von röntgeninduzierten ToxizitätenMit Hilfe eines Stereomikroskops wurden die folgenden Auffälligkeiten nach der medikamentösen Behandlung und/oder Bestrahlung beurteilt und charakterisiert. Gemäß den OECD-Richtlinien 61 wurden für die …

Discussion

Zebrafische werden als wertvolle Modelle in vielen Studien verwendet, darunter auch in verschiedenen Arten der Krebsforschung. Dieses Modell bietet eine nützliche Plattform für groß angelegte Drogenscreenings^67,68. Wie bei jeder anderen Methode zur Bewertung der Toxizität ist die quantitative Bewertung der wichtigsten biologischen Veränderungen nach Bestrahlung und/oder medikamentöser Behandlung der wichtigste Teil dieses Protokolls. Bei dieser Art von Stud…

Materials

6 Well plates	Corning	CLS3335	Polystyrene
B.O.D Incubator	Oswald	JRIC-10
Calcium Chloride	Fisher Scientific	10101-41-4
Dissecting Microscope	Zeiss	Stemi 2000
External Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTE	Polycarbonate
Glass petriplates	Borosil	3165A75	Glass
GraphpadPrism	GraphPad Software, Inc.		Version 5.01
Kline concavity slides	Himedia	GW092-1PK	Glass
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Methylene blue hydrate	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm	Tarsons	380020	Paraffin film
Pasteur pipettes	Himedia	PW1212-1X500NO	Polyethylene plastic
Perforated Internal Tank for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTI	Polycarbonate
Polycarbonate Divider for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTD	Polycarbonate
Polycarbonate Lid for the 1.0 L Breeding Tank	Tecniplast	ZB10BTL	Polycarbonate
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5655
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
Sodium hydroxide pellet	SRL	1949181
Stereo Microscope Leica M205FA	Leica	Model/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 Precision X-Ray	Precision X-Ray	X-RAD 225XL