O presente protocolo descreve a confecção de uma grande janela craniana (6 x 3 mm2) usando envoltório de alimentos, silicone transparente e vidro de cobertura. Esta janela craniana permite experiências de imagem de cálcio in vivo de campo largo e de dois fótons no mesmo rato.
A imagem de cálcio de campo amplo do neocórtex do rato permite observar a atividade neural em todo o córtex relacionada a várias funções cerebrais. Por outro lado, a imagem de dois fótons pode resolver a atividade de circuitos neurais locais no nível de célula única. É fundamental fazer uma grande janela craniana para realizar análises em várias escalas usando ambas as técnicas de imagem no mesmo mouse. Para conseguir isso, deve-se remover uma grande seção do crânio e cobrir a superfície cortical exposta com materiais transparentes. Anteriormente, crânios de vidro e janelas cranianas à base de polímero foram desenvolvidos para esse fim, mas esses materiais não são facilmente fabricados. O presente protocolo descreve um método simples para fazer uma grande janela craniana consistindo de filme de envoltório de cloreto de polivinilideno (PVDC) comercialmente disponível, um plugue de silicone transparente e um vidro de cobertura. Para a imagem da superfície dorsal de um hemisfério inteiro, o tamanho da janela foi de aproximadamente 6 x 3 mm2. Vibrações cerebrais severas não foram observadas, independentemente de uma janela tão grande. É importante ressaltar que a condição da superfície do cérebro não se deteriorou por mais de um mês. Imagens de campo amplo de um camundongo expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI), GCaMP6f, especificamente em astrócitos, revelaram respostas sincronizadas em poucos milímetros. Imagens de dois fótons do mesmo camundongo mostraram respostas proeminentes de cálcio em astrócitos individuais ao longo de vários segundos. Além disso, uma fina camada de um vírus adenoassociado foi aplicada ao filme PVDC e expressou com sucesso GECI em neurônios corticais sobre a janela craniana. Esta técnica é confiável e econômica para fazer uma grande janela craniana e facilita a investigação da dinâmica neural e glial e suas interações durante o comportamento nos níveis macroscópico e microscópico.
A imagem de cálcio de campo amplo investiga efetivamente o padrão de atividade espaço-temporal em uma grande área do cérebro animal 1,2,3. A imagem de campo amplo tem sido amplamente utilizada para observar toda a superfície cortical dos roedores, uma vez que seu córtex é relativamente plano 2,3,4,5,6,7,8,9,10. Camundongos transgênicos ou camundongos injetados com vírus adenoassociados (AAV), que expressam especificamente GECIs em várias células, como neurônios e células gliais, podem ser utilizados para imagens de cálcio de campo amplo11,12,13. No entanto, a resolução espacial dessa técnica geralmente não é suficiente para resolver a atividade de células individuais in vivo14. Também não é adequado para células de imagem localizadas em camadas mais profundas.
Por outro lado, a imagem de cálcio de dois fótons pode observar a atividade de múltiplas células simultaneamente com a resolução espacial subcelular, permitindo a observação da atividade de células individuais mesmo em dendritos neuronais e processos gliais 15,16,17,18,19,20,21,22. Também pode observar células em camadas mais profundas do córtex cerebral23,24. Embora os recentes avanços tecnológicos na microscopia de dois fótons permitam a obtenção de imagens de regiões corticais de milímetros de largura 25,26,27,28,29, ainda é difícil observar uma área comparável à imagem de campo amplo por meio de imagens de dois fótons.
Para entender a relevância fisiológica da atividade cerebral de célula única para cérebro inteiro, é fundamental preencher a lacuna entre a atividade das regiões corticais em todo o córtex e a resolução de uma única célula em circuitos neurais locais. Portanto, uma combinação de imagens de cálcio de campo amplo e de dois fótons realizadas no mesmo camundongo é especialmente eficaz. Para perceber isso, uma janela craniana larga e estável deve ser criada, idealmente durante um longo período.
Anteriormente, várias técnicas de confecção de janelas cranianas foram desenvolvidas para permitir a realização de imagens de campo amplo e de dois fótons no mesmo camundongo30,31. As janelas de vidro de cobertura em forma de trapezoidal (crânio de cristal), que são moldadas na forma da superfície cortical para substituir o osso removido, permitem o acesso óptico sobre todo o córtex32. Alternativamente, janelas cranianas à base de polímero podem ser feitas com polietileno tereftalato (PET)33 ou fluoropolímeros amorfos revestidos com polietileno revestidos com óxido de etileno nanofolha34. Cada método demonstrou manter uma janela estável por mais de 1 mês. No entanto, produzir essas janelas não é fácil, e os materiais e equipamentos utilizados são muitas vezes caros.
O presente estudo descreve um novo método para a confecção de uma grande janela craniana utilizando o filme PVDC (filme plástico alimentício) (Figura 1). Usando esta janela, experimentos de imagem in vivo de campo amplo e dois fótons podem ser realizados nos mesmos camundongos. Também foi demonstrado que os GECIs podem ser expressos em neurônios em uma ampla área do córtex de camundongos, formando uma fina camada de filme contendo partículas de AAV no envoltório.
Este artigo apresenta um método barato de criar uma grande janela craniana usando um filme plástico PVDC, silicone transparente e vidro de cobertura. Usando este método, mostramos que a imagem de cálcio de campo amplo poderia ser realizada em uma ampla área do córtex cerebral. A imagem de cálcio de dois fótons pode ser realizada a partir de várias regiões corticais diferentes no mesmo camundongo que foi submetido a imagens de campo amplo. Além disso, foi demonstrado que um filme de fibroína-AAV no filme plástico usado para a janela poderia expressar GECI em uma ampla área do córtex.
Etapas críticas
É importante evitar infecções e danos ao cérebro ao fazer janelas cranianas usando filme plástico. Nessas condições, a atividade neural e glial não pode ser observada, e a imagem de áreas mais profundas é impossível. A lesão dos vasos sanguíneos também resulta em sangramento, tornando a imagem impossível devido ao sangue. Para evitar a infecção, fazer com que a superfície do cérebro e o envoltório sejam presos o mais firmemente possível é fundamental, sugando a ACSF. A administração de manitol é importante para evitar danos cerebrais e nos vasos sanguíneos, evitando o aumento da pressão cerebral durante a cirurgia. Isso mantém o espaço entre a superfície do cérebro e a dura-máter e impede que o cérebro e os vasos sanguíneos sejam tocados durante a remoção do crânio e da dura-máter. Um microscópio estéreo com alta ampliação e pinças com pontas afiadas também são eficazes para uma cirurgia precisa.
No método fibroína-AAV, é essencial usar casulos de bicho da seda de carne, não congelar a solução de fibroína, secar suficientemente a solução de fibroína-AAV e aplicar volume suficiente de solução (5 μL por 3 mm de diâmetro). Quando casulos mais antigos foram usados, a eficiência de expressão foi menor. Isso ocorre porque a fibroína de casulos antigos pode ser desnaturada facilmente. Quando a solução de fibroína foi congelada a -80 °C e descongelada no momento do uso, a eficiência de expressão foi baixa. Isso pode ser devido à desnaturação da proteína devido ao congelamento e descongelamento. Uma vez que as soluções de fibroína armazenadas a 4 °C podem ser efetivamente utilizadas até à gelificação, recomenda-se que as soluções de fibroína sejam mantidas refrigeradas e purificadas a partir de casulos novamente após a gelificação. A solução de fibroína-AAV deve ser seca por pelo menos 3 h, pois a expressão é pobre após menos de 3 h. Finalmente, a área de expressão depende da quantidade de solução de fibroína-AAV utilizada. No exemplo da Figura 3M, a quantidade foi pequena (5 μL); assim, o filme de fibroína-AAV cobria apenas a metade superior da janela, resultando em expressão não uniforme sobre a janela. Se uma quantidade suficiente de fibroína-AAV for usada, a expressão será uniforme em toda a janela.
Modificações da técnica
A nova técnica de janela craniana permite examinar a atividade macroscópica dos circuitos corticais e sua atividade subjacente de nível de célula única no mesmo rato. Assim, o método pode ser aplicado a uma variedade de estudos de neurociência. Por exemplo, ele pode ser usado para observar a atividade cortical durante tarefas de tomada de decisão, aprendizagem motora e em modelos de ratos de lesão cerebral e doença. Também acreditamos que o método pode ser aplicado não apenas a roedores, mas também a primatas não humanos.
Este artigo demonstra que a grande janela craniana é eficaz para a imagem de camundongos transgênicos e camundongos injetados com AAV expressando proteínas funcionais. Em particular, é demonstrado que o filme de fibroína-AAV no envoltório é muito mais fácil do que um método convencional de injeção de AAV para expressar GECIs em toda a ampla área do córtex. Usando uma mistura de dois AAVs que codificam GECIs de cores diferentes41, a correlação entre a atividade do neurônio e das células gliais pode ser simultaneamente visualizada em uma ampla área do córtex. Além disso, o método do filme fibroína-AAV também pode ser aplicado a outros biossensores geneticamente codificados 42,43,44,45,46,47.
A janela craniana maior, que pode visualizar ambos os hemisférios, também é possível. Microscópios de dois fótons com um campo de visão muito mais amplo (~25 mm2) foram recentemente desenvolvidos 25,26,27,28,29. A combinação desta técnica de imagem de dois fótons com imagens de campo largo de um fóton usando a ampla janela craniana descrita aqui nos permitirá examinar a relação entre a atividade populacional e a atividade de célula única a partir de escalas sem precedentes.
Limitações
O invólucro alimentar não permite a passagem de quaisquer substâncias. Isso torna o método difícil de ser usado para experimentos farmacológicos. Também é difícil remover o envoltório, impossibilitando a inserção de uma pipeta ou eletrodo de vidro. Portanto, é difícil implementar experimentos combinados com outros métodos, como imagens simultâneas de cálcio e registros eletrofisiológicos, e administração local de drogas usando uma pipeta de vidro. Uma possível solução para essas limitações é usar o envoltório e a janela de vidro com um furo. Isso permite o acesso ao cérebro através de uma pipeta de vidro ou um eletrodo de gravação, mantendo a janela craniana estéril por um longo período48.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) ‘Glial Decoding’ (JP21H05621 to SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 to SM, 15KK0340 to ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 to HB e JP17H06313 to KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 to SM, JP19dm0207079 to HB e JP19dm0207080 to KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (to SM), Bolsa para Jovens Pesquisadores da Prefeitura de Yamanashi (para SM) e Takeda Science Foundation (para SM) e parcialmente apoiada pela Bolsa de Pesquisa Frontier Brain da Univ. Yamanashi.
Agradecemos a N. Yaguchi e K. Okazaki pelo cuidado com os animais e assistência técnica e aos membros do laboratório Kitamura pelas discussões úteis.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
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Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |