本协议描述了使用食品包装,透明硅胶和盖玻片制作大型(6 x 3 mm2)颅窗。该颅窗允许在同一只小鼠中进行 体内 宽场和双光子钙成像实验。
来自小鼠新皮层的宽场钙成像允许人们观察与各种大脑功能相关的皮层范围的神经活动。另一方面,双光子成像可以在单细胞水平上解析局部神经回路的活动。制作一个大的颅窗以在同一只小鼠中使用两种成像技术进行多尺度分析至关重要。为此,必须去除头骨的大部分,并用透明材料覆盖暴露的皮质表面。以前,已经为此目的开发了玻璃头骨和基于聚合物的颅窗,但这些材料不容易制造。本协议描述了一种制造由市售聚偏二氯乙烯(PVDC)包装膜,透明硅胶塞和盖玻片组成的大颅窗的简单方法。为了对整个半球的背表面进行成像,窗口尺寸约为6 x 3 mm2。无论如此大的窗口如何,都没有观察到严重的大脑振动。重要的是,大脑表面的状况没有恶化超过一个月。表达基因编码钙指示剂(GECI)GCaMP6f的小鼠的宽场成像,特别是在星形胶质细胞中,揭示了几毫米的同步反应。同一只小鼠的双光子成像在几秒钟内在单个星形胶质细胞中显示出明显的钙反应。此外,将一层腺相关病毒的薄层施加到PVDC薄膜上,并在颅窗上的皮质神经元中成功表达GECI。该技术对于制作大颅窗是可靠且具有成本效益的,并且有助于研究神经和神经胶质动力学及其在宏观和微观水平上的行为过程中的相互作用。
宽场钙成像有效地研究了动物大脑大面积的时空活动模式1,2,3。宽场成像已被广泛用于观察啮齿动物的整个皮质表面,因为它们的皮层相对平坦2,3,4,5,6,7,8,9,10。转基因小鼠或注射腺相关病毒(AAV)的小鼠,其在神经元和神经胶质细胞等各种细胞中特异性表达GECI,可用于宽场钙成像11,12,13。然而,该技术的空间分辨率通常不足以解析体内单个细胞的活性14。它也不适用于位于更深层的细胞成像。
另一方面,双光子钙成像可以同时以亚细胞空间分辨率观察多个细胞的活性,即使在神经元树突和神经胶质过程中也能观察单个细胞的活性15,16,17,18,19,20,21,22。它还可以观察大脑皮层更深层的细胞23,24。尽管双光子显微镜的最新技术进步能够从毫米宽的皮质区域25,26,27,28,29进行成像,但仍然难以观察到与双光子成像的宽场成像相当的区域。
为了了解从单细胞到全脑的大脑活动的生理相关性,弥合整个皮层上皮层区域的活动与局部神经回路中单细胞分辨率的活动之间的差距至关重要。因此,在同一只小鼠中进行宽场和双光子钙成像的组合特别有效。为了实现这一点,必须创建一个宽而稳定的颅窗,最好是长时间的。
以前,已经开发了几种制作颅窗的技术,以允许在同一只小鼠30,31中进行宽场和双光子成像。梯形盖玻片窗口(水晶头骨)被模制成皮质表面的形状以替换移除的骨骼,允许光学进入整个皮层32。或者,基于聚合物的颅窗可以用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)33 或聚环氧乙烷包覆的无定形含氟聚合物纳米片34制成。每种方法已被证明可以保持稳定的窗口超过1个月。然而,生产这些窗户并不容易,而且使用的材料和设备往往很昂贵。
本研究描述了一种使用PVDC薄膜(塑料食品包装)制作大颅窗的新方法(图1)。使用该窗口,可以在同一只小鼠中进行 体内 宽场和双光子成像实验。还表明,通过在包裹物上形成含有AAV颗粒的薄膜层,GECIs可以在小鼠皮层的广阔区域的神经元中表达。
本文介绍了一种使用 PVDC 保鲜膜、透明硅胶和盖玻片创建大型颅窗的廉价方法。使用这种方法,我们表明可以在大脑皮层的宽区域进行宽场钙成像。双光子钙成像可以从经过宽场成像的同一只小鼠的几个不同皮质区域进行。此外,已经表明,用于窗户的保鲜膜上的丝心蛋白-AAV薄膜可以在皮层的广阔区域表达GECI。
关键步骤
使用保鲜膜制作颅窗时,避免感染和对大脑的损害很重要。在这些条件下,无法观察到神经和神经胶质活动,并且不可能对更深的区域进行成像。血管损伤也会导致出血,使血液无法成像。为避免感染,通过吸出ACSF使大脑表面和包裹尽可能紧密地附着至关重要。甘露醇给药对于通过防止手术期间脑压升高来避免大脑和血管损伤很重要。这维持了大脑表面和硬脑膜之间的空间,并防止在切除颅骨和硬脑膜期间触摸大脑和血管。具有高放大倍率的体视显微镜和带有锋利尖端的镊子对于精确手术也很有效。
在丝心蛋白-AAV方法中,必须使用肉蚕茧,不要冷冻丝心蛋白溶液,充分干燥丝心蛋白-AAV溶液,并施用足够体积的溶液(每3mm直径5μL)。当使用较老的茧时,表达效率较低。这是因为来自旧茧的丝心蛋白可能很容易变性。当丝心蛋白溶液在-80°C冷冻并在使用时解冻时,表达效率较差。这可能是由于冷冻和解冻导致蛋白质变性。由于储存在4°C的丝心蛋白溶液可以有效地使用直到凝胶化,因此建议将丝心蛋白溶液冷藏并在凝胶化后再次从茧中纯化。丝心蛋白-AAV溶液应干燥至少3小时,因为不到3小时后表达不良。最后,表达面积取决于使用的丝心蛋白-AAV溶液的量。在 图3M的示例中,量很小(5 μL);因此,丝心蛋白-AAV膜仅覆盖窗口的上半部分,导致窗口上表达不均匀。如果使用足够量的丝心蛋白-AAV,则表达将在整个窗口中均匀。
技术的修改
新颖的颅窗技术允许人们在同一只小鼠中检查皮质回路的宏观活动及其潜在的单细胞水平活动。因此,该方法可以应用于各种神经科学研究。例如,它可用于观察决策任务、运动学习以及脑损伤和疾病的小鼠模型中的皮质活动。我们还认为,该方法不仅可以应用于啮齿动物,还可以应用于非人类灵长类动物。
本文表明,大颅窗对转基因小鼠和注射AAV表达功能蛋白的小鼠是有效的。特别是,表明包裹上的丝心蛋白-AAV膜比传统的AAV注射方法更容易在皮层的宽区域表达GECI。使用编码不同颜色GECI的两种AAV的混合物41,神经元和神经胶质细胞活动之间的相关性可以在皮层的宽阔区域同时成像。此外,丝心蛋白-AAV薄膜法还可以应用于其它基因编码的生物传感器42,43,44,45,46,47。
较大的颅窗也可以对两个半球进行成像。最近开发了具有更宽视场(~25 mm2)的双光子显微镜25,26,27,28,29。将这种双光子成像技术与使用此处描述的宽颅窗的单光子宽场成像相结合,将使我们能够从前所未有的规模检查群体活动与单细胞活动之间的关系。
局限性
食品包装不允许任何物质通过。这使得该方法难以用于药理学实验。取下包装也很困难,因此无法插入玻璃移液管或电极。因此,很难实施与其他方法相结合的实验,例如同时进行钙成像和电生理记录,以及使用玻璃移液管局部给药。针对这些限制的可能解决方案是使用带孔的包装和玻璃窗。这允许通过玻璃移液管或记录电极 进入 大脑,同时长时间保持颅窗无菌48。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了变革性研究领域补助金(A)“神经胶质解码”(JP21H05621至SM),JSPS KAKENHI(JP19K06883至SM,15KK0340至ES,JP22H00432,JP22H05160,JP17H06312至HB和JP17H06313至KK),疾病研究综合神经技术脑图谱资助(Brain/MINDS)(JP19dm0207079h0002至SM,JP19dm0207079至HB,JP19dm0207080至KK),成重神经科学研究基金会(至SM), 山梨县(SM)和武田科学基金会(SM)的青年研究员补助金,部分由山梨大学的前沿脑研究基金资助。
我们感谢N. Yaguchi和K. Okazaki的动物护理和技术援助,以及Kitamura实验室成员的有益讨论。
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
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Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |