يصف البروتوكول الحالي صنع نافذة جمجمة كبيرة (6 × 3 مم2) باستخدام غلاف الطعام والسيليكون الشفاف وغطاء زجاجي. تسمح هذه النافذة القحفية في الجسم الحي بإجراء تجارب تصوير الكالسيوم واسعة المجال وثنائية الفوتون في نفس الفأر.
يسمح تصوير الكالسيوم واسع المجال من القشرة المخية الحديثة للفأر بمراقبة النشاط العصبي على مستوى القشرة المتعلقة بوظائف الدماغ المختلفة. من ناحية أخرى ، يمكن للتصوير ثنائي الفوتون حل نشاط الدوائر العصبية المحلية على مستوى الخلية الواحدة. من الأهمية بمكان إنشاء نافذة جمجمة كبيرة لإجراء تحليل متعدد النطاقات باستخدام تقنيتي التصوير في نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يجب على المرء إزالة جزء كبير من الجمجمة وتغطية السطح القشري المكشوف بمواد شفافة. في السابق ، تم تطوير الجماجم الزجاجية ونوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر لهذا الغرض ، ولكن هذه المواد لا يتم تصنيعها بسهولة. يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لصنع نافذة جمجمة كبيرة تتكون من فيلم تغليف كلوريد البولي فينيليدين (PVDC) المتاح تجاريا ، وسدادة سيليكون شفافة ، وغطاء زجاجي. لتصوير السطح الظهري لنصف الكرة بأكمله ، كان حجم النافذة حوالي 6 × 3 مم2. لم تلاحظ اهتزازات الدماغ الشديدة بغض النظر عن هذه النافذة الكبيرة. الأهم من ذلك ، أن حالة سطح الدماغ لم تتدهور لأكثر من شهر واحد. كشف التصوير واسع المجال لفأر يعبر عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا (GECI) ، GCaMP6f ، وتحديدا في الخلايا النجمية ، عن استجابات متزامنة في بضعة ملليمترات. أظهر التصوير ثنائي الفوتون لنفس الفأر استجابات بارزة للكالسيوم في الخلايا النجمية الفردية على مدى عدة ثوان. علاوة على ذلك ، تم تطبيق طبقة رقيقة من فيروس مرتبط بالغدي على فيلم PVDC وعبر بنجاح عن GECI في الخلايا العصبية القشرية فوق نافذة الجمجمة. هذه التقنية موثوقة وفعالة من حيث التكلفة لصنع نافذة جمجمة كبيرة وتسهل التحقيق في الديناميات العصبية والدبقية وتفاعلاتها أثناء السلوك على المستويين العياني والمجهري.
يبحث تصوير الكالسيوم واسع المجال بشكل فعال في نمط النشاط الزماني المكاني على مساحة كبيرة من دماغ الحيوان1،2،3. تم استخدام التصوير واسع المجال على نطاق واسع لمراقبة السطح القشري الكامل للقوارض نظرا لأن قشرتها مسطحة نسبيا2،3،4،5،6،7،8،9،10. يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الفئران المحقونة بالفيروس المرتبط بالغدي (AAV) ، والتي تعبر على وجه التحديد عن GECIs في خلايا مختلفة مثل الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، لتصوير الكالسيوم واسع المجال11،12،13. ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية لهذه التقنية عادة لا تكفي لحل نشاط الخلايا الفردية في الجسم الحي14. كما أنها ليست مناسبة لتصوير الخلايا الموجودة في طبقات أعمق.
من ناحية أخرى ، يمكن لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون مراقبة نشاط خلايا متعددة في وقت واحد مع الدقة المكانية تحت الخلوية ، مما يسمح بمراقبة نشاط الخلايا الفردية حتى في التشعبات العصبية والعمليات الدبقية 15،16،17،18،19،20،21،22. يمكنه أيضا مراقبة الخلايا في الطبقات العميقة من القشرة الدماغية23,24. على الرغم من أن التطورات التكنولوجية الحديثة في الفحص المجهري ثنائي الفوتون تمكن من التصوير من المناطق القشرية بعرض ملليمتر25،26،27،28،29 ، إلا أنه لا يزال من الصعب مراقبة منطقة مماثلة للتصوير واسع المجال عن طريق التصوير ثنائي الفوتون.
لفهم الأهمية الفسيولوجية لنشاط الدماغ من خلية واحدة إلى الدماغ بأكمله ، من الأهمية بمكان سد الفجوة بين نشاط المناطق القشرية على القشرة بأكملها وذلك عند دقة الخلية الواحدة في الدوائر العصبية المحلية. لذلك ، فإن الجمع بين تصوير الكالسيوم واسع المجال والفوتون الذي يتم إجراؤه في نفس الماوس فعال بشكل خاص. لتحقيق ذلك ، يجب إنشاء نافذة جمجمة واسعة ومستقرة ، من الناحية المثالية على مدى فترة طويلة.
في السابق ، تم تطوير العديد من التقنيات لصنع نوافذ الجمجمة للسماح بإجراء تصوير واسع المجال وفوتونين في نفس الماوس30,31. تسمح النوافذ الزجاجية ذات الغطاء شبه المنحرف (الجمجمة البلورية) ، والتي يتم تشكيلها على شكل السطح القشري لتحل محل العظم الذي تمت إزالته ، بالوصول البصري عبر القشرة32 بأكملها. بدلا من ذلك ، يمكن صنع نوافذ الجمجمة القائمة على البوليمر باستخدام البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET)33 أو البوليمرات النانوية غير المتبلورة المطلية بأكسيد البولي إيثيلين34. وقد ثبت أن كل طريقة تحافظ على نافذة مستقرة لأكثر من 1 شهر. ومع ذلك ، فإن إنتاج هذه النوافذ ليس بالأمر السهل ، وغالبا ما تكون المواد والمعدات المستخدمة باهظة الثمن.
تصف الدراسة الحالية طريقة جديدة لصنع نافذة جمجمة كبيرة باستخدام فيلم PVDC (غلاف طعام بلاستيكي) (الشكل 1). باستخدام هذه النافذة ، يمكن إجراء تجارب التصوير واسعة المجال والفوتون في الجسم الحي في نفس الفئران. وقد تبين أيضا أنه يمكن التعبير عن GECIs في الخلايا العصبية على مساحة واسعة من قشرة الفئران عن طريق تشكيل طبقة رقيقة من الفيلم تحتوي على جزيئات AAV على الغلاف.
تقدم هذه المقالة طريقة غير مكلفة لإنشاء نافذة جمجمة كبيرة باستخدام غلاف بلاستيكي PVDC وسيليكون شفاف وغطاء زجاجي. باستخدام هذه الطريقة ، أظهرنا أنه يمكن إجراء تصوير الكالسيوم واسع المجال على مساحة واسعة من القشرة الدماغية. يمكن إجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون من عدة مناطق قشرية مختلفة في نفس الفأر الذي خضع لتصوير واسع المجال. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن فيلم fibroin-AAV على الغلاف البلاستيكي المستخدم للنافذة يمكن أن يعبر عن GECI على مساحة واسعة من القشرة.
خطوات حاسمة
من المهم تجنب العدوى وتلف الدماغ عند صنع نوافذ الجمجمة باستخدام غلاف بلاستيكي. في هذه الظروف ، لا يمكن ملاحظة النشاط العصبي والدبقي ، وتصوير المناطق العميقة أمر مستحيل. تؤدي إصابة الأوعية الدموية أيضا إلى النزيف ، مما يجعل التصوير مستحيلا بسبب الدم. لتجنب العدوى ، فإن جعل سطح الدماغ والالتفاف متصلا بإحكام قدر الإمكان أمر بالغ الأهمية عن طريق امتصاص ACSF. إدارة مانيتول مهمة لتجنب تلف الدماغ والأوعية الدموية عن طريق منع زيادة ضغط الدماغ أثناء الجراحة. هذا يحافظ على المسافة بين سطح الدماغ والأم الجافية ويمنع لمس الدماغ والأوعية الدموية أثناء إزالة الجمجمة والأم الجافية. مجهر ستيريو ذو تكبير عالي وملاقط ذات أطراف حادة فعالة أيضا لإجراء جراحة دقيقة.
في طريقة fibroin-AAV ، من الضروري استخدام شرانق دودة القز اللحمية ، وليس تجميد محلول الفبروين ، وتجفيف محلول fibroin-AAV بشكل كاف ، وتطبيق حجم كاف من المحلول (5 ميكرولتر لكل قطر 3 مم). عندما تم استخدام الشرانق القديمة ، كانت كفاءة التعبير أقل. وذلك لأن الفبروين من الشرانق القديمة قد يتم تغيير طبيعته بسهولة. عندما تم تجميد محلول الفبروين عند -80 درجة مئوية وإذابته في وقت الاستخدام ، كانت كفاءة التعبير ضعيفة. قد يكون هذا بسبب تمسخ البروتين بسبب التجميد والذوبان. نظرا لأنه يمكن استخدام محاليل الفبروين المخزنة عند 4 درجات مئوية بشكل فعال حتى الهلام ، فمن المستحسن أن يتم تبريد محاليل الفبروين وتنقيتها من الشرانق مرة أخرى بعد التبلور. يجب تجفيف محلول fibroin-AAV لمدة 3 ساعات على الأقل ، لأن التعبير ضعيف بعد أقل من 3 ساعات. أخيرا ، تعتمد منطقة التعبير على كمية محلول fibroin-AAV المستخدم. في المثال في الشكل 3M ، كانت الكمية صغيرة (5 ميكرولتر) ؛ وهكذا ، غطى فيلم fibroin-AAV النصف العلوي فقط من النافذة ، مما أدى إلى تعبير غير موحد فوق النافذة. إذا تم استخدام كمية كافية من fibroin-AAV ، فسيكون التعبير موحدا على النافذة بأكملها.
تعديلات على التقنية
تسمح تقنية نافذة الجمجمة الجديدة للمرء بفحص النشاط العياني للدوائر القشرية ونشاطها الأساسي على مستوى الخلية الواحدة في نفس الفأر. وبالتالي ، يمكن تطبيق الطريقة على مجموعة متنوعة من دراسات علم الأعصاب. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لمراقبة النشاط القشري أثناء مهام صنع القرار ، والتعلم الحركي ، وفي نماذج الفئران لإصابات الدماغ والمرض. نعتقد أيضا أنه يمكن تطبيق الطريقة ليس فقط على القوارض ولكن أيضا على الرئيسيات غير البشرية.
توضح هذه الورقة أن نافذة الجمجمة الكبيرة فعالة لتصوير الفئران المعدلة وراثيا والفئران المحقونة ب AAV التي تعبر عن البروتينات الوظيفية. على وجه الخصوص ، تبين أن فيلم fibroin-AAV الموجود على الغلاف أسهل بكثير من طريقة حقن AAV التقليدية للتعبير عن GECIs عبر المنطقة الواسعة من القشرة. باستخدام مزيج من اثنين من AAVs ترميز GECIs بألوان مختلفة41 ، يمكن تصوير العلاقة بين نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في وقت واحد على مساحة واسعة من القشرة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق طريقة فيلم fibroin-AAV على أجهزة استشعار حيوية أخرى مشفرة وراثيا42،43،44،45،46،47.
نافذة الجمجمة الأكبر ، والتي يمكنها تصوير نصفي الكرة الأرضية ، ممكنة أيضا. تم مؤخرا تطوير مجاهر ثنائية الفوتون ذات مجال رؤية أوسع بكثير (~ 25 مم2)25،26،27،28،29. إن الجمع بين تقنية التصوير ثنائية الفوتون هذه والتصوير واسع المجال لفوتون واحد باستخدام نافذة الجمجمة الواسعة الموصوفة هنا سيسمح لنا بفحص العلاقة بين النشاط السكاني ونشاط الخلية الواحدة من مقاييس غير مسبوقة.
القيود
لا يسمح غلاف الطعام بمرور أي مواد. هذا يجعل من الصعب استخدام الطريقة للتجارب الدوائية. من الصعب أيضا إزالة الغلاف ، مما يجعل من المستحيل إدخال ماصة زجاجية أو قطب كهربائي. لذلك ، من الصعب تنفيذ التجارب جنبا إلى جنب مع طرق أخرى مثل تصوير الكالسيوم في وقت واحد والتسجيلات الكهربية ، والإدارة المحلية للأدوية باستخدام ماصة زجاجية. الحل المحتمل لهذه القيود هو استخدام الغلاف والنافذة الزجاجية مع فتحة. هذا يسمح بالوصول إلى الدماغ عبر ماصة زجاجية أو قطب تسجيل مع الحفاظ على نافذة الجمجمة معقمة لفترة طويلة48.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلية (أ) “فك التشفير الدبقي” (JP21H05621 إلى SM) ، JSPS KAKENHI (JP19K06883 إلى SM ، 15KK0340 إلى ES ، JP22H00432 ، JP22H05160 ، JP17H06312 إلى HB ، و JP17H06313 إلى KK) ، منحة في المعونة لرسم خرائط الدماغ بواسطة التقنيات العصبية المتكاملة لدراسات الأمراض (الدماغ / العقول) (JP19dm0207079h0002 إلى SM ، JP19dm0207079 إلى HB ، و JP19dm0207080 إلى KK) ، مؤسسة ناريشيج لأبحاث علم الأعصاب (إلى SM) ، منحة للباحثين الشباب من محافظة ياماناشي (إلى SM) ، ومؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى SM) وبدعم جزئي من منحة أبحاث الدماغ الحدودية من جامعة ياماناشي.
نشكر N. Yaguchi و K. Okazaki على رعاية الحيوانات والمساعدة الفنية وأعضاء مختبر Kitamura على المناقشات المفيدة.
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution | NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
50 mL beaker | |||
Acquisition software | Brain vision | BV_Ana | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Acquisition software | Hamamatsu photonics | High speed recording software: HSR | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Acquisition software | Vibrio Technologies | scanImage | For two-photon calcium imaging |
ACSF (artificial cerebrospinal fluid) | 150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7.4 with 1M NaOH | ||
ACSF aspiration needle | |||
Adeno-associated virus | VectorBuilder | custom-made | AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R |
Adhesives for biological use | Daiichi Sankyo | Aron Alpha-A | |
Anesthesia machine | Shinano seisakusho | SN-487 | |
Anesthetic | Kyoritsu Seiyaku Corporation | pentobarbital | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Auxiliary ear bar | Narishige | EB-5N | |
CCD camera | Brain vision | MiCAM02-HR | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Clear vinyl polysiloxane | GC | Exaclear | |
CMOS camera | Hamamatsu photonics | ORCA-spark | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Cotton swab | |||
Cover glass | Matsunami | 18 x 18 NO.1 | Size: 18 x 18 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm, Borosilicate glass |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Ddialysis cassette | 3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer | ThermoFisher | |
Dental adhesive resin cement | SUN MEDICAL | Super-Bond | |
Dental drill | Nakanishi | VOLVERE Vmax | |
Digital scale | Dretec | KS-243 | |
Filters | Brain vision | EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50 | |
Filters | Olympus | U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ | |
Fluorescence microscope | Keyence | BZ-X810 | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Fluorescent beads | Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | 0.1 µm | Evaluation of the point spread function under the conventional and the new cranial windows in two-photon imaging |
Forceps | FST | No. 11252-20 | thin-tipped, for removal of dura mater |
Forceps | KFI | K-7, No.J 18-8 | for general use |
Gelatin for hemostasis | Johnson & Johnson | Spongostan | |
Gentamicin sulfate | Iwaki seiyaku | ||
Glass pipette | custom-made | ||
Hair remover | Reckitt Japan | Veet | |
Head fixing device | custom-made | Craniotomy for Cortical Voltage-sensitive Dye Imaging in Mice. Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722. | |
Head plate | custom-made | aluminum or resin, size: 40 x 25 mm, thickness: 1.5 mm or 2 mm, hole in the center: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d) | |
Heating pad | |||
Image processing software (for calcium imaging data analysis) | ImageJ | https://imagej.net | |
Isoflurane | Pfizer | ||
Light source | Hayashi-repic | LA-HDF108AA | |
Light source | Brain vision | LEX2-LZ4-B | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f |
Light source | Olympus | U-HGLGPS | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Mannitol solution (15% with saline) | Sigma-Aldrich (Merck) | M4125 | |
Micro curette | FST | No. 10080-05 | |
Microscope | Brain vision | For wide-field calcium imaging of GCaMP6f | |
Microscope | Olympus | MVX10 | For wide-field calcium imaging of XCaMP-R |
Microscope | Sutter Instruments | MOM | For two-photon calcium imaging |
Microslicer | Dosaka EM | DTK-1000N | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Mixing tip | GC | ||
Needle (30 G) | |||
Polyethylens spoids | AS ONE | 1-4656-01 | |
Polyvinylidene chloride (PVDC) film | Asahi Kasei | Asahi Wrap (or Saran Wrap) | |
Povidone-iodine | Mundipharma | Isodine | |
Python libralies | NumPy | package for scientific computing, https://numpy.org/doc/stable/index.html# | |
Matplotlib | library for visualizations, https://matplotlib.org/stable/index.html# | ||
pandas | data analysis and manipulation tool, https://pandas.pydata.org | ||
Scalpel | Kai | No. 11 | |
Shaver for animal | |||
Silicone dispensers | GC | ||
Silkworm cocoon | Satoyama Craft News | https://sato-yama.jp/ | |
Stereomicroscope | LEICA | MZ6 | objective lens: 0.63x, eyepiece: 25x |
Surfactant | NACALAI TESQUE | TritonX | Expression efficiency of the wrap with the fibroin-AAV film method |
Surgical Scissors | FST | No. 91460-11 | |
Syringe for mannitol injection | Terumo | 1mL | |
Transdermal anesthetic | AstraZeneca | Lidocaine | |
Transgenic mice used for calcium imaging of astrocytes | The mice were obtained by the following method. AldH1l1-CreERT2 mice: B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (The Jackson laboratory, strain #: 031008) Tamoxifen-inducible Cre recombinase expression directed at high levels to the vast majority of astrocytes Flx-Lck-GCaMP6f mice: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (The Jackson laboratory, strain #: 029626) Cre-dependent expression of a plasma membrane-targeted GCaMP6f. A mouse born from crossbreeding these mice were treated with tamoxifen (20 mg/mL) for 5 days (0.05 mL/10g bw, i.p.) to express GCaMP6f. |
||
Tunable ultrafast lasers | Spectra-Physics | InSight X3 | For two-photon calcium imaging |
Waterproof film | Nichiban | BFR5 | |
Wild-type mice | Japan SLC | C57BL/6J | Male and femalek, >4 weeks old |