A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.
A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. Aspectos críticos de doenças metastáticas, como o complexo microambiente neural e a interação de células estromais, não podem ser inteiramente replicados com ensaios in vitro ; assim, os modelos animais são fundamentais para investigar e compreender os efeitos da intervenção terapêutica. No entanto, a maioria dos métodos de xenoenxertia de tumores cerebrais não produz metástases cerebrais consistentemente em termos de período de tempo e carga tumoral. Modelos de metástases cerebrais gerados pela injeção intracardíaca de células cancerígenas podem resultar em carga tumoral extracraniana não intencional e levar à morbidade e mortalidade metastática não cerebral. Embora a injeção intracraniana de células cancerígenas possa limitar a formação de tumores extracranianos, ela tem várias ressalvas, como as células injetadas frequentemente formam uma massa tumoral singular no local da injeção, alto envolvimento leptomeníngeo e danos à vasculatura cerebral durante a penetração da agulha. Este protocolo descreve um modelo de rato de metástase cerebral gerada pela injeção da artéria carótida interna. Este método produz tumores intracranianos de forma consistente sem o envolvimento de outros órgãos, possibilitando a avaliação de agentes terapêuticos para metástases cerebrais.
A metástase cerebral é uma neoplasia maligna prevalente associada a um prognóstico muito ruim 1,2. O padrão de atendimento para pacientes com metástases cerebrais é multimodal, consistindo em neurocirurgia, radioterapia de todo o cérebro e/ou radiocirurgia estereotáxica, dependendo do estado geral de saúde dos pacientes, da carga de doença extracraniana e do número e localização de tumores no cérebro 3,4. Pacientes com até três lesões intracranianas são elegíveis para ressecção cirúrgica ou radiocirurgia estereotáxica, enquanto a radioterapia de todo o cérebro é recomendada para pacientes com lesões múltiplas para evitar o risco de infecção e edema relacionados à cirurgia5. No entanto, a radioterapia de todo o cérebro pode infligir danos às estruturas cerebrais radiossensíveis, contribuindo para a má qualidade de vida6.
A terapia sistêmica é uma alternativa não invasiva e uma abordagem lógica para o tratamento de pacientes com lesões múltiplas7. No entanto, é menos considerado devido à noção de longa data de que as terapias sistêmicas têm baixa eficácia, pois a entrega passiva de drogas citotóxicas através da corrente sanguínea não pode atingir níveis terapêuticos no cérebro sem o risco de toxicidade insegura8. Esse paradigma está começando a mudar com a terapia sistêmica recentemente aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA (tucatinibe com trastuzumabe e capecitabina, indicada para metástase cerebral metastática com câncer de mama HER2+)9,10,11,12 e a atualização nas diretrizes de tratamento para incluir a consideração de opções de terapia sistêmica para pacientes com metástase cerebral 13,14.
Nesse contexto, os desenvolvimentos no campo da terapia molecular direcionada, imunoterapia e sistemas alternativos de liberação de medicamentos, como um portador de nanofármacos direcionado, podem potencialmente superar os desafios do tratamento de metástases cerebrais15,16,17,18. Além disso, abordagens químicas e mecânicas para melhorar a administração de fármacos via permeabilização da barreira crânio-tumoral também estão sendo investigadas19,20. Para estudar e otimizar tais abordagens para serem adequadas ao propósito, é crucial usar modelos pré-clínicos que não apenas espelhem a complexa fisiologia da metástase cerebral, mas também permitam a análise objetiva da resposta intracraniana a medicamentos.
Em termos gerais, as abordagens atuais para modelar metástases cerebrais in vivo envolvem injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo), intravenosa (geralmente veia da cauda), intracraniana ou intracarótida (artéria carótida comum) de células cancerígenas em camundongos 21,22,23,24,25,26,27 . Além das estratégias de enxerto tumoral, modelos de camundongos geneticamente modificados em que a formação de tumores é desencadeada pela remoção de genes supressores de tumor ou ativação de oncogenes são úteis para a modelagem tumoral. No entanto, apenas alguns modelos de camundongos geneticamente modificados são relatados para produzir tumores secundários e ainda menos que produzem de forma confiável metástases cerebrais28,29,30.
Métodos de enxerto como injeção intracardíaca (ventrículo esquerdo) e intravenosa (geralmente veia da cauda) imitam a disseminação sistêmica do câncer. Esses modelos normalmente produzem lesões em múltiplos órgãos (por exemplo, cérebro, pulmões, fígado, rins, baço), dependendo do leito capilar que retém a maioria das células tumorais durante sua “primeira passagem” circulatória31. No entanto, taxas inconsistentes de enxerto cerebral exigirão mais animais para atingir o tamanho da amostra para o poder estatístico desejado. O número de células tumorais que eventualmente se estabelecem no cérebro através desses métodos de injeção intracardíaca e intravenosa é variável. Assim, a carga tumoral de metástase cerebral pode variar entre os animais e a diferença na progressão pode tornar a padronização da linha do tempo experimental e a interpretação dos resultados um desafio. A carga tumoral extracraniana pode levar à mortalidade por metástases não cerebrais, tornando esses modelos inadequados para avaliar a eficácia intracraniana. Linhagens celulares cérebro-trópicas têm sido estabelecidas usando processos de seleção clonal artificial para reduzir o estabelecimento extracraniano, mas as taxas de tomada têm sido inconsistentes, e o processo de seleção clonal pode reduzir a heterogeneidade normalmente encontrada em tumores humanos32.
Métodos de enxerto específicos do cérebro, como a injeção intracraniana e intracarótida, permitem uma modelagem de metástases cerebrais mais consistente e eficiente. No método intracraniano33, as células cancerosas são tipicamente injetadas no córtex cerebral frontal, o que gera crescimento tumoral rápido e reprodutível com baixo envolvimento sistêmico. Embora o procedimento seja bem tolerado com baixa mortalidade33, as ressalvas são de que é uma abordagem relativamente grosseira que introduz rapidamente um bolo (localizado) de células no cérebro e não modela a patogênese precoce da metástase cerebral. A agulha danifica a vasculatura do tecido cerebral, o que causa inflamação localizada 5,34. Por experiência, há uma tendência de células tumorais injetadas para refluxo durante a remoção da agulha, levando ao envolvimento leptomeníngeo. Alternativamente, o método intracarotídeo entrega células na artéria carótida comum com microvasculatura cerebral como o primeiro leito capilar a ser encontrado, modelando a sobrevivência na circulação, extravasamento e colonização24. Concordando com outros25, nossa experiência com esse método constatou que ele pode resultar em tumores faciais devido à entrega não intencional de células cancerígenas através da artéria carótida externa para leitos capilares nesses tecidos (dados não publicados). É possível prevenir tumores faciais ligando primeiro a artéria carótida externa antes da injeção da artéria carótida comum (Figura 1). No resto do artigo, este método é referido como a “injeção interna da artéria carótida”. A partir da experiência, o método de injeção da artéria carótida interna gera consistentemente metástases cerebrais com muito poucos eventos sistêmicos e tem sido bem-sucedido na geração de modelos de metástases cerebrais de diferentes cânceres primários (por exemplo, melanoma, mama e câncer de pulmão) (Figura 1). As desvantagens são que é tecnicamente desafiador, demorado, invasivo e requer otimização cuidadosa do número de células e um cronograma de monitoramento. Em resumo, os métodos de injeção intracraniana e interna da artéria carótida produzem modelos de camundongos adequados para avaliar o impacto terapêutico no benefício de sobrevida relacionado ao tumor cerebral.
Este protocolo descreve o método de injeção da artéria carótida interna para produzir um modelo de metástase cerebral em camundongo com quase nenhum envolvimento sistêmico e, portanto, adequado para avaliação pré-clínica da distribuição de medicamentos e eficácia da terapêutica experimental.
Figura 1: Representação esquemática do protocolo de injeção da artéria carótida interna para metástase cerebral. A injeção interna da artéria carótida com ligadura externa da artéria carótida pode produzir de forma confiável um modelo de metástase cerebral de vários cânceres primários. Neste protocolo, três ligaduras são colocadas na artéria carótida (anotadas como L1-L3 na figura). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A metástase cerebral é um processo complexo de células cancerosas que se espalham de seu local primário para o cérebro. Diferentes modelos animais estão disponíveis que espelham certos estágios desse processo de várias etapas e há considerações fisiológicas e práticas para o desenho de estudos pré-clínicos de metástases41,42. A maioria dos estudos publicados que investigam o uso da nanomedicina para o tratamento de metástases cerebrais utilizou …
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pelo Conselho Nacional Australiano de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC), número de concessão APP1162560. O ML foi financiado por uma bolsa de pesquisa de pós-graduação da UQ. Gostaríamos de agradecer a todos que ajudaram com a criação de animais e imagens in vivo dos animais. Agradecemos ao Royal Brisbane and Women’s Hospital por doar alíquotas de zircônio para este estudo.
100µm cell strainer | Corning | CLS431752 | |
30G Microlance needle | BD | 23748 | |
31G Ultra-Fine II insulin syringe | BD | 326103 | |
Angled forceps | Proscitech | T67A-SS | Fine pointed, angled without serrations, 18mm tip, length 128 mm |
Animal heat mat | |||
Antibiotic and antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | |
Autoclave bags | |||
BT-474 (HTB-20) breast cancer cell line | ATCC | HTB-20 | |
Buprenorphine (TEMGESIC) | |||
Countess cell counter | ThermoFisher Scientific | C10227 | |
Diet-76A | ClearH2O | 72-07-5022 | |
Dissection microscope | |||
Ear puncher | |||
Electric clippers | |||
Fine angled forceps | Proscitech | DEF11063-07 | Angled 45°, Tip smooth, Tip width: 0.4 mm, Tip dimension: 0.4 x 0.3 mm, length 9cm |
Fine tubing for cannula, Tubing OD (in) 1/32, Tubing ID (in) 1/100in | Cole Parmer | EW-06419-00 | |
Foetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Hank's Balanced Salt Solution without calcium and magnesium | ThermoFisher Scientific | 14170120 | |
Hydrogel | ClearH2O | 70-01-5022 | |
Isoflurane | |||
Kimwipes Low lint disposable wipers | Kimberly Clark- Kimwipes | Z188964 | |
Mashed mouse chow | |||
Meloxicam (METACAM) | |||
Nose cone | Fashioned out of a microfuge tube | ||
PAA ocular lubricant (Carbomer 2mg/g) | Bausch and lomb | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | 2505692 | |
PPE (glove, mask, gown, hairnet) | |||
Retractors | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
RPMI 1640 Media | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
Silk suture 13mm 5-0, P3, 45cm | Ethicon | JJ-640G | |
Sterile normal saline | ThermoFisher Scientific | TM4469 | |
Sticky tape | |||
Surgical board | A chopping board wrapped with autoclavable bag. | ||
Surgical scissors | Proscitech | T104 | Tip Dimensions (LxD): 38x7mm, Length 115mm |
Suture forcep/ Curved Brophy forceps | Proscitech | T113C | Curved, Rounded narrow 2 mm tip, with serrations, length 165 mm |
Suture needle holder (Olsen Hegar needle holder) | Proscitech | TC1322-180 | length 190 mm, ratchet clamp |
Syringe driver with foot pedal/ UMP3 Ultra micro pump | World Precision Instruments | UMP3-3 | |
T75 tissue culture flask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
Thread | |||
Trigene II surface disinfectant | Ceva | ||
Trypan Blue and Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | |
TrypLE Express dissociating medium | ThermoFisher Scientific | 12605010 |